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背景和目的:近年来,重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的发病率随着人们生活水平的提高逐年上升,SAP并发症多、死亡率高,对人类健康带来极大的威胁。肠功能障碍是SAP最常见的并发症之一,是导致胰腺坏死组织继发感染、加剧病情进展的主要原因。然而,SAP肠功能障碍的具体机制目前仍不清楚,因此,明确SAP肠功能障碍的机制及早期治疗尤为重要。NLRP3炎症小体是宿主固有免疫系统的重要组成部分,其过度活化能够引起IL-1β等一系列促炎因子的大量释放,介导炎症免疫反应。肠道微生物作为被人们长期遗忘的器官,它与人类的健康和疾病有着密切的关系。近年来不少研究报道肠道菌群失衡与SAP的发生发展有关,肠道菌群紊乱时可通过影响肠粘膜的炎症免疫反应破坏肠粘膜屏障,继而引起肠道细菌移位、内毒素血症等并发症。因此,本研究拟从肠道微生态失衡角度探讨肠粘膜NLRP3炎症小体激活-炎症免疫反应在SAP发生发展过程中肠粘膜屏障功能障碍中的作用及机制。材料与方法:1.建立野生型C57BL/6J小鼠SAP的动物模型,采用雨蛙素联合脂多糖腹腔注射构建。2.检测正常对照组和造模后6h、12h、24h组小鼠的血淀粉酶水平以及胰腺、小肠组织病理学改变。3.Western blot法测定小肠组织NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC、Caspase-1、Caspase-1 p10)的表达。D-乳酸检测试剂盒测定小鼠血清中D-乳酸水平。ELISA法检测小鼠血清中相关促炎因子(IL-1β、IL-17、TNF-a)的含量。Western blot、IHC法检测小肠组织中肠粘膜紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-4)的表达。相关性分析比较NLRP3与炎症因子、D-乳酸、肠粘膜紧密连接蛋白之间的关系。4.通过16S rDNA高通量测序法检测正常对照组和造模后6h、12h、24h组小鼠肠道菌群的变化。相关性分析比较NLRP3与肠道菌群变化之间的关系。结果:1.SAP造模后不同时间点小鼠血淀粉酶及胰腺、小肠组织病理学的改变(1)6h、12h、24hSAP组小鼠血清淀粉酶含量较正常对照组均明显升高(p<0.05)。(2)SAP组小鼠胰腺组织病理评分明显高于正常对照组(p<0.01),且24hSAP组小鼠胰腺组织病理评分明显高于6hSAP组、12hSAP组(p<0.05),而6hSAP组与12hSAP组小鼠胰腺组织病理评分并无明显差异(p>0.05)。(3)SAP组小鼠小肠组织病理评分明显高于正常对照组(p<0.01),且24hSAP组小鼠小肠组织病理评分明显高于6hSAP组(p<0.05),6hSAP组与12hSAP组、12hSAP组与24hSAP组小鼠小肠组织病理评分之间无明显差异(p>0.05)。2.SAP造模后不同时间点小鼠小肠组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达及血清中相关促炎因子的含量,各组小鼠肠粘膜通透性的变化以及小肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4的表达。(1)SAP造模组小鼠小肠组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 p10的表达明显高于正常对照组(p<0.05),各造模时间点之间的表达无明显差异(p>0.05);Caspase-1的表达在正常对照组与造模后不同时间之间均无明显差异(p>0.05)。(2)SAP造模组小鼠血清IL-1β、IL-17、TNF-a的含量明显高于正常对照组(p<0.05)。(3)24hSAP组小鼠血清中D-乳酸的含量较正常对照组、6hSAP组明显升高(p<0.05),而6hSAP组与12hSAP组之间、12hSAP组与24hSAP组之间D-乳酸的含量无明显差异(p>0.05)。(4)24hSAP组小鼠小肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-4的表达较正常对照组明显下降(p<0.05)。(5)小肠组织中NLRP3的表达与IL-1β、IL-17、D-乳酸的含量呈显著正相关,与ZO-1、Occludin的表达呈显著负相关,与TNF-a、Claudin-4的表达无明显相关性。3.SAP造模后不同时间点小鼠肠道菌群的变化(1)测序分析示各组小鼠肠道菌群在门水平共注释到9个门,主要为Bacteroidetes拟杆菌门、Firmicutes厚壁菌门、Proteobacteria变形菌门、Actinobacteria放线菌门、Verrucomicrobia疣微菌门、Cyanobacteria蓝藻门、Spirochaetes螺旋菌门、Deferribacteres脱铁杆菌门、Others未分类。(2)随着SAP造模时间延长,小鼠肠道菌群多样性呈下降趋势,24hSAP组肠道菌群的多样性较Control组、6hSAP组显著降低(p<0.00),且24hSAP组肠道菌群多样性也低于12hSAP组(p<0.05)。(3)PCA、PCoA分析示SAP造模组小鼠肠道菌群组成与Control组存在差异,其中24hSAP组的肠道菌群与Control组之间的差异最为明显。(4)门水平上,24hSAP组Bacteroidetes拟杆菌门、Actinobacteria放线菌门、Verrucomicrobia疣微菌门的含量明显低于Control组(p<0.05),而Proteobacteria变形菌门的含量明显增加(p<0.00);属水平上,24hSAP组Bacteroidales_S24-7_group、Akkermansia属、Desulfovibrio脱硫弧菌属等有益菌的含量较Control组减少(p<0.05),而Escherichia-Shigella埃希氏-志贺氏菌属、Enterococcus肠球菌属、Proteus变形杆菌属等致病菌的含量明显增加(p<0.01)。(5)SAP小鼠肠道中Escherichia-Shigella、Enterococcus、Proteus等致病菌的增多与小肠组织中NLRP3表达上调密切相关。结论:1.SAP进展过程中肠道NLRP3炎症小体的激活与肠功能障碍的发生密切相关。2.SAP进展过程中出现肠道菌群紊乱,且Escherichia-Shigella埃希氏-志贺氏菌属、Enterococcus肠球菌属、Proteus变形杆菌属等致病菌的增加与肠道中NLRP3炎症小体的激活有一定关系。