论文部分内容阅读
研究目的和意义肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上高发的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第三位。在中国,肝细胞癌的新发病例数和死亡率高居世界前列,其中,乙型肝炎病毒感染占大多数。在广西地区,肝细胞癌是死亡率最高的恶性肿瘤。由于肝细胞癌起病隐匿、肿瘤生长迅速、转移性高,多数患者就诊时已经属于中晚期。虽然目前肝脏手术切除或肝移植等治疗手段可缓解病人情况,但是术后肿瘤复发和转移严重影响患者的生活质量。因此,深入研究肝细胞癌的发生、发展机制,探索针对肝细胞癌早期、特异性诊断标志物和治疗靶点十分必要,这将为肝细胞癌的诊断和治疗提供有力依据。肝细胞癌是一种高度异质性的基因源性肿瘤。肿瘤基因本身不仅可导致细胞癌变,而且可通过表观遗传学水平调控引起肝细胞的癌变,主要包括甲基化、乙酰化、基因印记、染色体修饰和非编码RNA调控等。其中,最近的研究证实,长链非编码RNA（long noncoding rnas,lnc RNAs）在恶性肿瘤发生、发展中起到重要作用,如lnc RNA PCA,HOTAIR,H19等。长链非编码RNA是一类长度大于200nt核苷酸RNA,既可以位于胞质内,也可以位于胞核内,主要在转录水平或转录后水平调控相关靶基因,影响肿瘤细胞生物学功能。随着深入研究发现,lnc RNAs在不同肿瘤组织中具有特异性表达,这使lnc RNAs可能作为特定肿瘤的早期筛查生物标志物,并且相关机制研究也证实,lnc RNAs可作为特异性肿瘤生物靶向标志物,进行干预治疗。因此,lnc RNAs在恶性肿瘤诊断和治疗中具有良好应用前景。随着人类基因组计划的完成和生物信息学技术的发展,蛋白质组和转录组等相关组学研究迅速兴起。在“后基因时代”中,新一代基因检测技术也迅速发展,高通量测序芯片和表达谱芯片从根本上改变了转录组学的思维方式,为我们提供有力研究工具。高通量表达谱芯片是一种深度检测转录组的常用分析工具,包括lnc RNAs探针和m RNAs探针,主要是整体在单核苷酸水平检测特定物种的转录本,其优点是检测已知转录本定位准、灵敏度高,可为肿瘤研究提供全面的转录组水平信息,筛选肿瘤差异表达基因,为机制研究提供科学依据。目前,lnc RNAs在肝细胞癌早中期的表达和机制分析尚不完全清楚。本研究拟在转录组表达谱芯片的基础上,对早中期肝细胞癌的转录组基因进行整体的分析和验证,发现参与肝细胞癌发生、发展过程的差异lnc RNAs和m RNAs,验证重要差异lnc RNAs,并深入分析其与m RNAs的关系,探究目标lnc RNAs参与的相关肝细胞癌通路和可能的发病机制,为肝细胞癌的诊断和治疗提供可靠的依据。研究方法在第一部分中,通过高通量表达谱芯片筛选差异lnc RNAs和m RNAs及其亚组关系,利用GO、KEGG分析差异基因参与相关通路,进一步通过GSEA,本研究深入探究整体转录基因簇参与的癌症相关通路。在第二部分中,依据第一部分差异表达结果,本研究使用RT-PCR方法验证人群中差异表达的10个ln RNAs,并通过受试者工作曲线分析,探究目标lnc RNAs是否可作为肝细胞癌预测诊断标志物。进一步,通过TCGA数据库挖掘,验证目标差异lnc RNAs是否可做预后评价标志物。最后,利用共表达网络分析和IPA（Ingenuity Pathway Analysis）,探索重要lnc RNAs和m RNAs参与调控肝细胞癌发生、发展的信号通路,预测癌症预后的可能机制。研究结果一.肝细胞癌差异表达基因分析1.通过高通量表达谱芯片检测,结果显示4433个差异的lnc RNAs,5210个差异的m RNAs,并与已发表的肝细胞癌文献对比,结果显示有4个常见差异lnc RNAs。2.GO和KEGG分析结果显示,m RNAs参与的重要调控通路,主要与细胞周期,剪切接拼通路等有关。3.GSEA分析结果显示,重要基因簇主要参与代谢和免疫相关通路,如P53信号通路,Toll样受体信号通路等。二.长链非编码RNA的初步验证1.通过对HCC人群的RT-PCR实验验证,结果显示9个显著差异的lnc RNAs,其中有4个上调和5个下调,其表达与芯片结果一致。2.通过两个HCC人群样本验证,ENST00000524045,ENST0000042149和NR002763 3个lnc RNAs组成联合诊断模型可以作为预测肝细胞癌诊断标志物,其中ENST00000524045对早期肝细胞癌诊断预测有较好效果。3.通过TCGA数据的预后分析,结果显示ENST00000443523、ENST00-000524045、ENST00000508147 3个lnc RNAs与肝细胞癌病人总生存时间有密切关系。4.通过共表达网络分析,结果显示差异lnc RNAs和m RNAs参与肝细胞癌发生相关通路,主要结果显示与细胞周期,PPAR信号通路和DNA复制有关。5.通过IPA,结果显示了重要m RNAs调控网络,主要为重要的核内基因CCND1,CDK1参与细胞周期调控早期肝细胞癌的发生、发展。研究结论在肝细胞癌发生、发展过程中,差异表达lnc RNAs起到重要作用,参与潜在的细胞周期调控;候选目的lnc RNAs通过人群验证,证实了在肝细胞癌人群中差异表达,并且与预测诊断肝细胞癌、预后有密切关系。其中,ENST00000524045与ZFPM2的相互作用可能在肝细胞癌中发挥重要机制作用。