研究背景及目的生物标志物是客观测量和评价的,用于反映正常生理/病理过程,或者在治疗中作为药理学反应指标。它能够帮助疾病的分子生物学分型和评估患者对治疗的反应,与临床终点相比,生物标志物可作为替代终点,提供相关信息。目前,生物标志物的研究成为疾病分级和药物临床评价中发展最快的领域之一,具有重要的应用价值。细胞内生物标志物作为生物标志物的一种,与细胞内信号通路作用机制密切相关,不仅能够帮助临床风险评估、疾病分型、疾病进程、疗效检测等方面,还能及时有效来衡量一个人是否对新药产生反应,从而提高药物和生物制剂的开发效率。经文献研究发现,国内关于生物标志物流式方法的研究整体起步晚,且药企和研发机构容易忽视分析方法的研究,尤其在细胞内生物标志物的流式分析方法方面较为缺乏。为此,本课题选了p-CREB（CREB磷酸化）、Ki-67（人MKI67基因编码的蛋白质）、H3K27me3（组蛋白H3第27位赖氨酸甲基化）细胞内生物标志物作为研究对象,三种标志物具有不同的生物学特性,因此,在方法建立中需要解决的难点、重点各不相同。本研究课题希望建立GLP条件下CREB、Ki67、H3K27Me3的流式细胞术检测方法,并探讨方法的应用潜力。研究方法与结果本研究共分为三个部分第一部分:p-CREB生物标志物的方法建立与验证选用EDTA-K2采血管收集健康成人外周血样本,依次经过添加NECA（N-ethyl-5-carboxamidoadenosine）刺激剂、固定透化、细胞表面和内部染色、上机等步骤。同时,对血药孵育时间（药物为CREB磷酸化抑制剂）、上机前是否添加多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）等试验条件进行优化,并对精密度和稳定性进行方法学验证。结果显示,血药孵育时间为3 h时,药物对细胞（CD4+T细胞、CD8+T细胞）p-CREB水平抑制率更佳;加入PFA组,药物对细胞（CD4+T细胞、CD8+T细胞）p-CREB水平的抑制作用更加明显。精密度符合接受标准,样品稳定性不符合接受标准。第二部分:Ki-67生物标志物的方法建立与验证先使用CPT采血管收集人外周血,接着在实验室进一步提取成PBMC样品,并完成细胞表面染色、固定透化、胞内染色、上机等一系列试验步骤。本研究过程中,对检测样本进行了探索,同时也对残留、荧光溢漏、精密度、灵敏度、干扰、稳定性等验证项进行验证。结果显示,残留、荧光溢漏、精密度均通过验证,同时样品在3倍稀释时符合灵敏度验证,样品在-80℃条件下7 d稳定以及样本处理后室温放置0.5 h稳定。第三部分:H3K27me3生物标志物的方法建立与验证使用EDTA-K2采血管收集人外周血样本,依次进行裂解红细胞、细胞表面染色、固定透化、胞内染色、上机检测等试验过程。在研究过程中,对Alexa Fluor647anti-histone H3K27me3 antibody抗体浓度、是否加入Fc受体封闭剂等实验条件进行方法优化,并对精密度、样本稳定性、处理后样本稳定性、特异性等验证项进行方法性验证。结果显示,当0.8μg/m L AF747-H3K27me3抗体浓度时,信噪比结果最优,选择给该抗体浓度;加入混合小鼠血清作为Fc封闭剂时,可提高信噪比、降低背景值;方法的批内精密度、批间精密度、特异性均符合接受标准,并且样本在2～8℃放置48 h、样品处理后室温放置2 h均保持稳定。研究结论1、p-CREB磷酸化生物标志物的流式分析方法已进行方法优化,并通过精密度验证。但根据实验结果可知细胞经刺激后,p-CREB磷酸化生物标志物不稳定,容易受到体系中其他因素改变的影响试验结果,并且较难保持一致的刺激程度。2、本研究建立了检测健康成人外周血T细胞中Ki-67表达的FCM分析方法,并在试验过程中发现健康成人外周血T细胞（CD3+、CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+）中的Ki-67 Ki-67阳性率低。3、经过方法优化和验证,成功建立了一种基于流式细胞术检测人外周血粒细胞和单核细胞中H3K27me3表达水平的方法。