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非酒精性脂肪性肝纤维化是非酒精性脂肪肝炎（NASH）进展成肝硬化的关键病理过程,是NASH远期预后的关键,其有效防治可防止终末期肝病的发生。因此,寻找安全、高效、低毒、副作用小的天然药物对非酒精性肝病的防治具有重要意义。肝星状细胞（HSC）是NASH/纤维化进展中的主要细胞类型,它的激活和增殖,使得细胞外基质（ECM）过度生成并沉积,导致肝纤维化的形成。NASH/肝纤维化的机制尚未完全清楚,其中炎症反应和氧化应激是主要的病理机制。炎症反应释放的多种炎症因子,不仅影响HSC的活化、增殖和分化,还能调节HSC的迁移和定位,从而影响肝纤维化进展进程。异常的氧化应激反应产生过量的过氧化物,增强肝脏炎症反应从而引起肝细胞损伤,促进HSC的活化增殖。因此,抑制肝脏炎症反应和氧化应激可以减轻NASH/肝纤维化。氧化物增殖酶体激活物受体γ（PPAR-y）是一种Ⅱ型核受体,是糖脂代谢过程中的主要调节因子。近期研究发现PPAR-γ具有维持HSC静息状态细胞表型及生物活性的作用。PPAR-γ激动剂可抑制TGF-β1表达,抑制HSC增殖和驱动活化HSC凋亡改善脂肪性肝纤维化。此外,PPAR-γ具有抑制炎症和氧化应激的特性。因此,PPAR-γ可能是治疗非酒精性脂肪性肝纤维化的有效靶点。丹参酮ⅡA是脂溶性丹参酮中研究最充分、药理活性最强的化合物。丹参酮ⅡA具有多种生物活性,包括减少脂质氧化和活性氧生成、抗凋亡、抗炎和抗纤维化等。目前,研究发现丹参酮ⅡA对不同疾病均有明显的改善作用,但是其对NASH/肝纤维化的具体疗效和机制尚未完全研究清楚。而且丹参酮ⅡA是否通过调节PPAR-γ介导的相关信号通路发挥抗纤维化作用,需要进一步研究。研究目的1.探讨丹参酮ⅡA是否通过抑制炎症和氧化应激抑制非酒精性脂肪肝纤维化的进展。2.利用体内外实验探讨丹参酮ⅡA抑制非酒精性脂肪肝纤维化的具体分子机制。研究方法1.动物实验雄性C57BL/6小鼠随机分成以下3组,每组20只。（1）对照组（Control）:常规饲料喂养,腹腔隔日注射橄榄油（5mL/kg.bw）;（2）模型组（HFD+CC14）:高脂饲料喂养,腹腔隔日注射10%CC14-橄榄油溶液（5mL/kg.bw）;（3）丹参酮干预组（TAN）:高脂饲料喂养,腹腔隔日注射10%CC14-橄榄油溶液（5mL/kg.bw）,并每日皮下注射10mg/kg丹参酮ⅡA。按上述干预方式连续干预8周。2.细胞实验1大鼠星状细胞系HSC-T6细胞接种于六孔板,将细胞分为四组:（1）对照组（Control）:细胞培养24小时,加入同等浓度的DMSO溶液。（2）模型组（TGF-β1）:细胞培养24小时,加入10ng/mLTGF-β1。（3）低剂量干预组（TAN-L）:细胞培养24小时,加入10ng/mL TGF-β1,再次培养24h后加入5μL丹参酮ⅡA,培养24小时。（4）高剂量干预组（TAN-H）:细胞培养24小时,加入10ng/mLTGF-β1,再次培养24小时后加入20μL丹参酮ⅡA,培养24小时。3.细胞实验2HSC-T6细胞接种于六孔板,将细胞分为四组:（1）对照组（Control）:细胞培养24小时,加入同等浓度的DMSO溶液。（2）模型组（TGF-β1）:细胞培养24小时,加入10ng/mLTGF-β1。（3）干预组（TANⅡA）:细胞培养24小时,加入10ng/mLTGF-β1,再次培养24小时后加入20μL丹参酮ⅡA,培养24小时。（4）PPAR-γ抑制剂组（T0070907）:细胞培养24小时,加入10ng/mL TGF-β1和10μL T0070907,再次培养24小时后加入20μL丹参酮ⅡA,培养24小时。研究结果1.丹参酮ⅡA通过抑制炎症反应和氧化应激抑制非酒精性脂肪肝纤维化（1）丹参酮ⅡA抑制高脂饮食联合CCL4诱导小鼠的炎症反应与对照组相比,模型组小鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β浓度均显著增加,此外,炎症信号通路TLR4-NF-κB被激活,TLR4、MyD88、NF-κB和IKK-β的mRNA和蛋白水平都显著增加。使用丹参酮ⅡA干预之后,小鼠的炎症反应明显被抑制,血清TNF-α、IL-6和IL-1β浓度下降,TLR4-NF-κB信号通路的相关蛋白的表达也显著降低。（2）丹参酮ⅡA抑制高脂饮食联合CCL4诱导小鼠的氧化应激结果显示,模型组小鼠血浆中的SOD、GSH水平与对照组相比显著下降,但MDA浓度显著增加,但通过丹参酮ⅡA治疗后SOD、GSH水平升高,而MDA水平下降。同时,在肝脏组织中也发现了相同的现象。使用ELISA试剂盒检测了肝脏组织中的CAT浓度,结果显示,与对照组比较,模型组中CAT活性显著降低,与模型组比较,丹参酮ⅡA治疗组肝脏组织中CAT活性显著增加（P＜0.05）。（3）丹参酮ⅡA抑制高脂饮食联合CCL4诱导小鼠的纤维化Masson染色结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肝小叶可见广泛的蓝色胶原沉积,汇管区和中央静脉周围可见明显的纤维组织增生,可见“假小叶”形成。丹参酮ⅡA干预组,汇管区和中央静脉周围纤维组织增生明显被改善,蓝色纤维胶原沉积减少。而Sirius Red染色结果显示,模型组较对照组红色胶原大量分布与肝脏组织中,而丹参酮ⅡA干预可以明显减少红色胶原的形成。免疫荧光结果发现,与对照组相比,模型组表达α-SMA和collagen-1阳性细胞数量明显增加,提示α-SMA和collagen-1大量分泌,Western blotting的结果同样显示模型组的α-SMA和collagen-1的蛋白表达明显增加。丹参酮ⅡA干预之后,免疫荧光结果显示α-SMA和collagen-1阳性细胞数量减少,Western blotting的结果显示α-SMA和collagen-1的蛋白表达显著被抑制。2.丹参酮ⅡA在体内外调节PPAR-Smad信号通路改善非酒精性脂肪肝纤维化（1）丹参酮ⅡA上调纤维化小鼠PPARγ与对照组相比,模型组小鼠肝脏PPAR-γmRNA和蛋白水平均显著降低（数值）,而丹参酮ⅡA干预组小鼠PPAR-γmRNA和蛋白水平均明显升高（数值）。之后免疫荧光也得到了相似的结果,丹参酮ⅡA干预显著增加了 PPAR-γ的表达。（2）丹参酮ⅡA调节纤维化小鼠JAK2/STAT5/PPAR-γ/Smad2/3信号通路与对照组相比,模型组小鼠肝脏组织中JAK2和STAT5的磷酸化水平均显著降低,而Smad2/3的磷酸化水平显著升高,差异均具有显著性意义。经丹参酮ⅡA干预之后,小鼠肝脏组织中JAK2和STAT5的磷酸化水平升高,而Smad2/3的磷酸化水平下降。（3）丹参酮ⅡA抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞炎症与对照组相比,TGF-β1诱导的HSC-T6细胞炎症因子（IL-6和TNF-α）分泌水平显著升高,当使用丹参酮ⅡA干预（5μL,20μL）,可以显著下降炎症因子的分泌水平。细胞炎症因子的mRNA表达发现了相同的趋势。（4）丹参酮ⅡA抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞氧化应激与对照组相比,使用TGF-β1活化的HSC-T6细胞ROS生成明显增多。而相较于TGF-β1诱导组,高低剂量的丹参酮ⅡA均能不同程度地降低ROS地生成,有显著性差异。此外我们检测了其他氧化应激指标,结果显示,TGF-β1活化HSC-T6后,细胞的SOD、GSH水平显著下降,但MDA浓度显著增加,但通过丹参酮ⅡA（5,20μL）干预后SOD、GSH水平升高,而MDA水平下降（P＜0.05）。（5）丹参酮ⅡA抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞纤维化Western blotting结果显示,与正常HSC细胞相比,TGF-β 1诱导的HSC-T6细胞的α-SMA和collagen-Ⅰ的蛋白表达显著增加,高低剂量的丹参酮ⅡA都可以降低α-SMA和collagen-Ⅰ的蛋白表达,但是只有高剂量组的有显著性差异。免疫荧光可以看到相似的结果。丹参酮ⅡA上调TGF-β1诱导的HSC-T6细胞PPAR-γ与对照组相比,活化的HSC细胞表达更低的PPAR-γ的蛋白和mRNA水平,而20μL的丹参酮ⅡA可以显著上调PPAR-γ的表达。（7）丹参酮 ⅡA 调节 HSC-T6 细胞 JAK2/STAT5/PPAR-γ/Smad2/3 信号通路与对照组相比,TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞中JAK2和STAT5的磷酸化水平均显著降低,而Smad2/3的磷酸化水平显著升高,差异均具有显著性意义。经丹参酮ⅡA（20μL）干预之后,小鼠肝脏组织中JAK2和STAT5的磷酸化水平升高,而Smad2/3的磷酸化水平下降。（8）应用PPAR-γ的抑制剂后丹参酮ⅡA抗纤维化作用和机制均减弱使用丹参酮ⅡA联合PPAR-γ抑制剂T0070907干预细胞后,丹参酮ⅡA对炎症和氧化应激的抑制作用被逆转了。与单独丹参酮ⅡA干预组相比,丹参酮ⅡA+T0070907干预组的炎症因子的表达显著升高,同时细胞的SOD、GSH水平显著下降,但MDA浓度显著增加。此外,与单独丹参酮ⅡA干预相比,丹参酮ⅡA+T0070907联合干预可以显著增加α-SMA和collagen-Ⅰ的蛋白表达。、应用PPAR-y抑制剂后,PPAR-y的mRNA和蛋白表达明显被抑制。另外Western blotting的结果显示,丹参酮ⅡA+T0070907联合干预可以抑制PPAR-y诱导的Smad2/β磷酸化水平的增加。研究结论（1）丹参酮ⅡA抑制非酒精性脂肪肝纤维化小鼠纤维化的进展,包括抑制炎症反应、氧化应激以及纤维化形成。（2）丹参酮ⅡA抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞纤维化（3）丹参酮ⅡA通过调节JAK2/STAT5/PPAR-γ/Smad2/3信号通路抑制非酒精性脂肪肝纤维化