背景乙型肝炎病毒（HBV）感染依然是严重的全球公共卫生问题,全球大约仍有2.4亿慢性HBV感染患者,HBV持续感染带来的慢性炎症和激活免疫细胞作用引起肝细胞损伤,与肝硬化（LC）、肝细胞癌（HCC）等终末期肝病的发生密切相关,严重危害人类健康。目前HBV感染在我国仍然高发,且无特效治疗方式。各乙型肝炎防治指南均将HBV表面抗原（HBsAg）清除作为慢性乙型肝炎（CHB）患者抗病毒治疗的理想终点,HBsAg清除是慢性HBV感染功能性治愈的标志,然而当前抗病毒药物不能有效促进HBsAg清除,且影响HBsAg清除的免疫机制仍亟待明确。近年来代谢物调控免疫系统以控制免疫应答愈发得到重视。代谢对免疫细胞的活化和分化过程非常重要,免疫应答需要机体能量代谢改变辅以实现细胞功能激活,分裂、分化和执行效应能力。代谢本身亦可调控免疫细胞命运的可塑性,此前已发现肿瘤或感染的代谢重编程与效应T细胞的功能下调有关。在机体脂代谢过程中,长链脂肪酸必须与左旋肉碱（L-Cn）酯化为脂酰肉碱后才能穿过线粒体膜进行β氧化。长链脂肪酸在细胞质被活化为脂酰辅酶A,脂酰辅酶A进一步在肉碱棕榈酰转移酶1的作用下与L-Cn结合生成脂酰肉碱,再在肉碱棕榈酰转移酶2的作用下还原为脂酰辅酶A以进行β氧化。其中,L-Cn通过脏器细胞上高亲和力有机阳离子转运体2（OCTN2）在细胞内累积,且肝细胞具有不同的低亲和力却高效的OCTN2肉碱转运体。人体所需的L-Cn从日常膳食中可获得75%,25%可在肝、肾、脑等部位以赖氨酸和甲硫氨酸为原料合成。连续一个月摄入富含L-Cn的红肉可显著上调血浆L-Cn水平。既往研究发现脂代谢在T细胞分化及功能发挥过程中起了关键作用。已有研究表明HBV相关LC、HCC患者血清L-Cn水平显著高于健康志愿者,且基于聚乙二醇干扰素抗病毒治疗基线低血浆L-Cn水平有利于患者实现HBsAg清除。可见,L-Cn是影响慢性HBV感染转归的重要因素之一。既往研究发现L-Cn对免疫细胞具有免疫抑制作用,但L-Cn在HBV感染中对免疫系统的影响甚少了解。宿主的特异性免疫功能对于病毒控制至关重要。机体接触HBV引发病毒特异性免疫反应,在次级淋巴器官形成生发中心（GC）,GC除了富含B细胞,还有滤泡辅助性T细胞（CXCR5+CD4+）、滤泡细胞毒性T细胞（CXCR5+CD8+）和滤泡调节性T细胞（FoxP3+CXCR5+CD4+）等,B细胞在GC内与其他细胞相互作用,才能够分化为长寿命的浆细胞,产生高亲和力的抗体。近年来,本课题组靶向GC相关免疫细胞,发现外周血CXCR5+CD4+T细胞通过分泌IL-21促进慢乙肝患者发生HBeAg血清学转换;CXCR5+CD8+T细胞可被募集到肝内发挥抗病毒作用,促进HBsAg清除;而外周血FoxP3+CXCR5+CD4+T细胞可抑制CXCR5+CD4+T细胞和B细胞的功能。提示GC反应在控制HBV感染中发挥重要作用。我们推测,在慢性HBV感染中L-Cn可作用于体内多种免疫细胞亚群,通过抑制GC反应发挥负性免疫调节作用,在影响HBsAg清除中发挥重要作用。目的本研究通过HBV感染自然史不同阶段的横向人群和接受抗病毒治疗前后的CHB患者纵向队列揭示L-Cn在慢性HBV感染中的代谢特点以及与HBsAg清除之间的关系;通过体外实验和动物实验阐明L-Cn对GC的影响,进一步探索L-Cn对GC相关免疫细胞功能的调节作用,揭示其影响HBsAg清除的免疫机制;通过体内外实验探索L-Cn的来源和影响因素,探讨通过干预机体L-Cn水平指导慢性HBV感染者临床管理和靶向免疫系统代谢调控开发新型治疗药物的意义。方法横向研究对象共纳入98例未经抗病毒治疗慢性HBV感染患者、24例经抗病毒治疗后实现HBsAg清除患者（HBsAg loss）、30例HBV相关HCC患者（HBV-HCC）以及22例健康志愿者（HC）。其中,未经抗病毒治疗慢性HBV感染患者包括乙肝e抗原（HBeAg）阳性慢性感染者（HBeAg+CInf）25例,HBeAg阳性慢性肝炎患者（HBeAg+CHep）30例,HBeAg阴性慢性感染患者（HBeAg-CInf）34例和HBeAg阴性慢性肝炎患者（HBeAg-CHep）9例。此外,还纳入了 38例进行肝脏穿刺的ETV治疗的慢性乙型肝炎患者。纵向研究对象来源于替比夫定（LDT）或聚乙二醇干扰素α-2a（Peg-IFNα-2a）治疗临床研究队列。LDT或Peg-IFNα-2a治疗队列分别共纳入18例和32例HBeAg+CHep患者,所有研究对象在抗病毒治疗基线、12周、24周和48周收集血清和肝素钠抗凝血。根据治疗48周后应答情况分为完全应答组（CR）和非完全应答组（NCR）,CR组定义为获得HBeAg转阴且产生HBeAb伴随HBV DNA低于1000 copies/mL,NCR组定义为未达到HBeAg血清学转换或HBV DNA高于1000 copies/mL。此外,648例HBeAg+CHep患者接受每周180μg聚乙二醇干扰素治疗后随访24周,用于评估单核苷酸多态性（SNP）和72周实现完全应答（HBeAg血清学转换伴随HBVDNA低于2000 IU/mL）的关系。另外,招募了 8名健康志愿者通过膳食干预进行L-Cn负荷试验。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测研究对象血浆中L-Cn水平,通过相关性分析探索影响L-Cn水平的相关因素。反复冻融HepG2.2.15细胞和采用对乙酰氨基酚（APAP）构建急性肝损伤小鼠模型探究血浆L-Cn的来源。通过分析GEO数据库（GSE62595）和进行RNA测序分析免疫细胞差异性基因的表达。L-Cn体外刺激后,采用流式细胞术和酶联免疫斑点实验（ELISpot）检测对免疫细胞表型和功能的变化。以及尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒建立HBV感染小鼠模型,水源管理及腹腔注射L-Cn后,通过苏木精-伊红（HE）染色和免疫荧光染色检测脾内GC形成情况,检测血清中病毒学指标观察L-Cn对HBV控制的影响。通过LDT或Peg-IFNα-2a治疗队列标本的血浆L-Cn动态定量分析,运用受试者工作特征（ROC）曲线探索机体L-Cn水平对抗病毒治疗疗效的预测价值。以及探索膳食管理调节血浆L-Cn水平的可能性。提取外周血单个核细胞（PBMC）提DNA后检测SNP,探索血浆L-Cn水平与SNP关系及挖掘影响L-Cn水平的其它因素。结果1.L-Cn在慢性HBV感染中的特点1.1在不同结局的慢性HBV感染患者中证实,慢性HBV感染者和HBV-HCC患者血浆L-Cn水平显著高于HC组,获得HBsAg清除患者其血浆L-Cn水平较HBsAg阳性患者和HBV-HCC患者显著下降,肝炎活动患者血浆L-Cn水平明显升高;1.2与HBsAg清除或HBsAg水平＜100 IU/mL的患者相比,HBsAg水平≥100 IU/mL的患者血浆L-Cn水平明显升高;1.3血清HBsAg、HBeAg和HBVDNA水平和血浆L-Cn水平呈正相关。2.肝炎活动肝细胞破裂释放胞内L-Cn是血浆L-Cn升高的主要原因2.1慢性乙型肝炎患者血清ALT、AST水平与血浆L-Cn水平呈正相关;2.2肝脏穿刺病理显示为中重度病理炎症患者的血浆L-Cn水平较轻度或无炎症患者显著升高;2.3反复冻融HepG2.2.15细胞的上清L-Cn水平与被破坏细胞数呈现依赖性;2.4 APAP诱导急性肝损伤小鼠模型实验发现,APAP处理后2小时L-Cn水平达到峰值,而血清ALT水平则逐渐升高。3.L-Cn对GC相关免疫细胞发挥免疫抑制作用3.1 L-Cn体外刺激慢性乙肝患者PBMC,测序后差异基因行基因集合富集分析发现L-Cn显著下调了 T细胞受体和B细胞受体信号通路;3.2高浓度L-Cn抑制外周血CXCR5+CD4+T细胞和CXCR5+CD8+T细胞增殖,下调其细胞因子IFN-γ和IL-21分泌,抑制B细胞增殖以及HBV相关抗体产生,但上调抑制性细胞FoxP3+CXCR5+CD4+T细胞频数及其分泌IL-10能力。3.3高浓度L-Cn上调外周血CXCR5+CD4+T细胞表达PD1和CD160,上调 CXCR5+CD8+T细胞表达 PD1、CTLA4、Tim3、CD160 和 LAG3 等抑制性受体,以及上调B细胞表达BTLA,且促进抑制性细胞FoxP3+CXCR5+CD4+T细胞表达抑制性受体TIGIT。4.L-Cn干预阻碍HBV表达质粒携带小鼠模型生发中心形成和HBsAg清除4.1 HBV表达小鼠实验发现,L-Cn水源添加管理及腹腔注射后第7、14、21和28天,实验组小鼠血清HBsAg水平显著高于对照组,L-Cn干预后第28天实验组小鼠血清HBsAb水平明显低于对照组小鼠;4.2 L-Cn干预后第35天,实验组小鼠脾脏GC数量及面积显著减少。5.L-Cn水平受膳食调控且可以预测抗病毒治疗疗效5.1动态观察接受LDT或Peg-IFNα-2a治疗48周的HBeAg阳性CHB患者各时间点血浆L-Cn水平,结果显示血浆L-Cn随治疗时间下调,且CR组患者抗病毒治疗基线血浆L-Cn水平显低于NCR组。ROC曲线分析显示,治疗基线低血浆L-Cn水平可预测LDT或Peg-IFNα-2a治疗的良好治疗反应。5.2健康志愿者空腹12小时后,进行“L-Cn负荷试验”-进食240g牛肉,约含L-Cn 180mg,发现血浆L-Cn水平波动平缓;但经过一周“L-Cn负荷试验”-每天进食两餐各220g牛肉,约含L-Cn 330mg/天,血浆L-Cn水平升高。5.3影响血浆L-Cn水平的其它相关因素:SNP rs179982（CPT2基因）GG基因型患者血浆L-Cn水平低于AA基因型患者;高BMI（＞25 kg/m2）健康志愿者血浆L-Cn水平低于低BMI（＜18 kg/m2）志愿者。结论1.HBsAg清除患者血浆L-Cn低于HBsAg阳性患者和HBV-HCC患者,CHB患者其血浆L-Cn水平显著高于慢乙肝携带状态;2.反复冻融细胞破裂和急性肝细胞损伤小鼠模型实验发现肝细胞损伤导致L-Cn升高,提示慢乙肝感染者血浆L-Cn水平升高可能与肝炎活动时被破坏的肝细胞释放有关;3.L-Cn显著下调细胞免疫应答相关的转录谱,提示L-Cn发挥免疫抑制作用;高浓度L-Cn抑制外周血CXCR5+CD4+T细胞、CXCR5+CD8+T细胞以及B细胞增殖,下调细胞因子IFN-γ和IL-21分泌以及HBV相关抗体产生,增强FoxP3+CXCR5+CD4+T细胞功能,提示L-Cn对GC相关免疫细胞发挥直接免疫抑制作用;4.在HBV小鼠实验中,L-Cn干预可减少小鼠脾脏GC数量,血清HBsAg持续表达且HBsAb产生减少,提示L-Cn通过抑制GC反应阻碍HBsAg清除;5.CHB患者LDT或Peg-IFNα-2a治疗基线血浆L-Cn水平可预测治疗48周后HBeAg血清学转换,提示L-Cn可作为评估CHB患者抗病毒疗效的代谢指标;短期“L-Cn负荷试验”志愿者血浆L-Cn波动平缓,提示L-Cn可以作为一种潜在的稳定的血浆代谢指标;长期“L-Cn负荷试验”志愿者血浆L-Cn水平上调,提示膳食管理可有效调节血浆L-Cn水平,针对HBV感染进行低L-Cn膳食干预可能有助于改善患者的预后。