背景随着卤素阻燃剂被许多国家限制使用,有机磷阻燃剂（organophosphorus flame retardants,PFRs）作为新一代的一类阻燃剂逐渐得到广泛使用。目前在环境和人群样本中均发现PFRs的广泛存在,且PFRs可引起内分泌紊乱、神经系统发育障碍、生殖及免疫系统缺陷等毒性效应。然而,关于其是否具有遗传毒性,特别是毒性与代谢的关系仍不清楚。2-乙基己基二苯基磷酸酯（2-ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP）作为一个环境暴露普遍且毒性较强的代表性PFR化合物,目前对其遗传毒性作用及其与特定人和小鼠CYP酶催化的代谢反应的关联性,尚缺乏报道。此外,双酚（bisphenol,BPs）类化合物作为应用广泛的塑化剂与EHDPP存在共暴露的风险;课题组前期研究发现BPs在低纳摩尔浓度即可通过影响人类细胞不同核受体的表达继而增强下游CYP酶表达水平。因此,BPs是否在EHDPP的代谢活化和遗传毒性作用发挥作用值得进一步研究。目的探讨EHDPP对哺乳类细胞的遗传毒作用、其代谢活化依赖的人和小鼠CYP酶、比较人和小鼠种属的代谢反应性差异以及BPs化合物对EHDPP毒作用的影响,并在转录组学筛选分子靶标的基础上揭示EHDPP对细胞内活性氧类和抗氧化物质水平、细胞周期及凋亡的影响。方法（1）以计算机模拟分子对接分析EHDPP与多个人源CYP酶（hCYP1A1、hCYP1A2、hCYP1B1、hCYP2B6、hCYP2E1、hCYP3A4,为迄今报道的有机物代谢涉及的主要CYP酶）的底物-酶反应潜能。在此基础上,采用重组表达上述人特定CYP酶的中国仓鼠肺成纤维（V79）细胞系（对照细胞系V79-Mz,本身不具有任何人CYP酶活性）及人肝癌（HepG2）细胞系,通过微核试验、着丝粒免疫荧光染色法、γ-H2AX水平（DNA损伤标志物）与单细胞凝胶电泳试验等探讨EHDPP经特定人CYP酶代谢激活的遗传毒作用及染色体损伤机制。（2）分析小鼠与人类种属对EHDPP的酶促反应差异性。构建小鼠CYP酶（mCYP1A1、mCYP1A2、mCYP2B10、mCYP2E1、mCYP3A11）蛋白三维结构,用分子对接方法分析EHDPP与小鼠不同CYP酶的底物-酶反应潜能,并与人类同源CYP酶的分子对接、实验结果相比较;此外,分析BPs对HepG2细胞、小鼠肝癌（Hepa1-6）细胞和小鼠体内模型肝脏中核受体[芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor,AhR）、孕烷X受体（pregnane X receptor,PXR）、组成型雄甾烷受体（constitutive androstane receptor,CAR）]和 CYP 酶表达水平的影响,并在此基础上观察BPs对EHDPP诱发这两种细胞遗传毒作用的影响。综合上述观察指标,判断BPs对人和小鼠肝细胞核受体和CYP酶的作用与差异,初步评估小鼠模型在EHDPP代谢活化、遗传毒性研究上对人类的代表性。（3）利用转录组学技术筛选EHDPP致人肝细胞毒性的分子靶标,采用RT-qPCR和Western blot进行验证,并用荧光标记法和底物催化显色等方法分析ROS、抗氧化物质、细胞凋亡水平及细胞周期的改变及其与EHDPP代谢的关联性。结果（1）分子对接结果显示,除人CYP1A1外,其余所有受试CYP酶（人CYP1A2、CYP1B1、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4）与 EHDPP 之间均符合酶-底物催化反应条件;而随后利用稳定表达上述CYP酶的重组V79细胞进行的EHDPP（5～40μM）微核试验结果与分子对接结果呈现一致性:即除V79-Mz和V79-hCYP1A1外,EHDPP可诱发重组表达其余CYP酶的V79衍生细胞系微核细胞率显著升高。此外,BPAF可增强EHDPP对HepG2细胞微核形成及DNA双链断裂作用。免疫荧光分析显示EHDPP对V79-hCYP2E1-hSULT1A1、V79-hCYP3A4-hOR细胞诱发的微核以不含着丝粒者为主,而对HepG2细胞则选择性诱发不含着丝粒的微核（与已知致断裂剂EMS类似）,表明EHDPP对染色体效应特征为致断裂作用。（2）构建了小鼠CYP酶蛋白三维结构,分子对接结果显示受试小鼠CYP酶中除 CYP1B1 外,其余 CYPs（小鼠 CYP1A1、CYP1A2、CYP2E1、CYP2B10、CYP3A11）与EHDPP之间均符合酶-底物反应条件;其中小鼠CYP2E1酶的代谢活化作用在稳定表达小鼠CYP2E1酶的V79（V79-mCYP2E1）细胞系得到验证:EHDPP诱发该细胞系微核细胞率增加,而对照细胞V79-Mz无明显反应。此外,EHDPP可诱发经BPAF预处理的小鼠肝癌Hepa1-6细胞微核形成,且该效应被小鼠同源酶CYP1A1、CYP2E1、CYP2B10的抑制剂所阻断,而CYP1B1、CYP1A2、CYP3A11抑制剂未呈现明显的阻断作用。进一步实验显示BPs（包括BPA、BPS、BPF和BPAF）在纳摩尔水平即可促进人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞核受体（AhR和PXR）和下游CYP酶的基因转录;而采用各个BP化合物对上述两种细胞进行预处理,可显著增强EHDPP诱发两种细胞的微核形成和DNA双链断裂效应。此外BPAF和阳性对照物PCB126分别灌胃处理雌性小鼠均可增强小鼠肝微粒体总CYP酶活性及其蛋白表达水平,并促进EHDPP在小鼠肝微粒体代谢系统中的代谢速率。上述研究结果提示EHDPP可由小鼠和人类CYP酶（尽管亚型不很一致）活化而获得遗传毒性能力;此外BPs可通过促进人和小鼠CYP酶的表达水平,并增强EHDPP基于代谢激活的遗传毒作用。（3）转录组测序的结果表明,EHDPP（10 μM）可引起HepG2细胞多个功能基因改变,包括葡萄糖代谢、氧化应激和细胞周期阻滞等。采用重组V79和HepG2细胞观察EHDPP对氧化应激的影响,结果在V79-hCYP3A4-hOR、V79-hCYP2E1-hSULT1A1、HepG2和正常人肝（L-02）细胞观察到ROS水平升高,而V79-Mz细胞ROS无变化;同时,EHDPP引起HepG2和L-02细胞的还原型谷胱甘肽（Reduced glutathione,GSH）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平升高,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性上升,并且这些效应均被ABT减弱或阻断。此外EHDPP可促进HepG2和L-02细胞的凋亡和细胞周期阻滞于G1期,以及p53信号通路关键分子p53和p21表达水平升高。结论（1）EHDPP可经人类CYP酶系代谢活化从而诱发哺乳动物（包括人类）细胞染色体/DNA双链断裂,其中人CYP3A4、CYP2E1和CYP2B6起主要作用。（2）BPs可激活小鼠肝细胞和小鼠肝脏（体内模型）某些核受体进而增强其下游CYP酶表达水平,由此促进EHDPP基于代谢激活的遗传毒作用,与人类细胞的反应相似。结果提示小鼠种属作为研究BPs通过增强CYP酶表达而促进间接致突变物效应的模型生物,一定程度上具有对人类的代表性。（3）EHDPP可诱导人肝细胞DNA损伤、氧化应激、细胞周期阻滞和凋亡等毒性效应,且CYPs催化的代谢增毒在其中具有重要作用。在分子机制层面,p53信号通路的激活可能是一个EHDPP致人肝细胞毒性的重要机制。