肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤,其中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。近年来,尽管在早期诊断、手术切除、靶向药物及化疗药物研发等方面了取得了不小进步,但其死亡率仍高,5年生存期偏低,复发率偏高。因此,针对肺癌的基础与临床研究一直是科学工作者关注的热点。既往对NSCLC的研究主要集中在蛋白编码基因及相关信号通路在肺癌发生发展中的作用,而与基因表达异常关系密切的非编码序列如micro RN As (miRNAs)的关注度则不够,随着miRNAs的不断发现以及对其生物学功能的了解,miRNAs在肿瘤中的作用引起了高度重视。miRNAs是一类微小非编码RNA,其通过靶向沉默诸多与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞运动以及细胞生长等生物学过程关系密切的基因,发挥重要的调控作用。越来越多的研究表明,miRNAs在肿瘤等疾病中通过负性调控肿瘤相关靶基因发挥抑制或促进肿瘤的作用,直接参与了肿瘤的发生和发展。前期的研究发现,肺癌尤其是非小细胞肺癌中存在miRNAs异常表达,其中一些miRNAs在肺癌的诊断、治疗及预后等方面可能具有潜在的应用价值。我们通过查阅文献,选取了一组肿瘤抑制基因样作用的miRNAs,初步观察它们对NSCLC细胞系A549细胞增殖的影响,结果显示：miR-7和miR-34a可以明显抑制A549肺癌细胞的增殖,而miR-101、miR-146以及let-7g对A549肺癌细胞增殖作用则未见明显影响。另外,近期有研究报道,miR-7在脑胶质瘤、垂体瘤以及乳腺肿瘤组织中的表达较癌旁对照组明显下调,进而对EGFR、PAK1等靶基因作用减弱,导致类似肿瘤抑制基因作用的功能降低。结合近期的研究发现,我们希望进一步了解,在NSCLC肿瘤组织中,miR-7的表达及作用如何?miR-7除了现有的靶基因,是否还存在新的靶基因以及新靶基因在非小细胞肺癌中作用又如何?这也是本文旨在回答的科学问题。有鉴于此,我们在分析研究NSCLC肿瘤组织中miR-7表达水平的基础上,通过改变NSCLC来源的肿瘤细胞中miR-7表达水平,研究miR-7对非小细胞肺癌细胞的作用方式及其作用机制,并对其靶基因进行生物信息学预测、正向及负向调控等实验验证及作用机制研究,继而阐明miR-7在NSCLC发生、发展中的作用及其机制,为非小细胞肺癌诊断、靶向药物设计提供理论和实验依据。第一部分microRNA-7在非小细胞肺癌中的表达及作用miRNAs是近年来研究的“热点分子”,成熟miRNA分子可以在转录和翻译水平对靶基因的表达进行精确调控。miRNAs广泛地影响着包括癌基因和肿瘤抑制基因在内各种信号分子及信号通路。研究发现,miR-155,let-7,miR-21,miR-34a及miR-7等miRNAs在不少肿瘤组织及细胞中表达异常,这种miRNA的表达异常将导致对靶基因调控产生紊乱,致使与肿瘤发生密切相关的细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等生物学行为发生改变,进而参与肿瘤发生和进展。近期人们对脑胶质瘤及乳腺癌等肿瘤组织细胞的研究发现,miR-7可能系一种肿瘤抑制基因,通常低水平表达于胶质瘤组织中,过表达miR-7可以负性调控肿瘤细胞生长。我们的实验结果也表明,miR-7可以抑制A549细胞的增殖。然而,在肿瘤组织中,miR-7的表达和作用如何?有待深入研究和探索。为了研究miR-7在NSCLC组织中的表达,我们收集了23对肺癌手术切除的新鲜NSCLC肿瘤组织及其癌旁对照组织标本,提取其总RNA,利用realtime PCR方法检测了miR-7在NSCLC肿瘤组织中的表达情况。结果发现：与癌旁对照组比较,miR-7在非小细胞肺癌组织的表达明显下调,差异具有统计学意义(p=0.01561)；此外,NSCLC细胞株A549、H1299和H1355细胞中,miR-7的表达较正常胚胎肺成纤维细胞MRC5的表达水平明显降低。这些结果表明miR-7通常在NSCLC组织及细胞中呈现低水平表达状态。既然miR-7在NSCLC组织细胞中表达下调,那么其对NSCLC来源的肺癌细胞的作用又如何?为了研究miR-7对非小细胞肺癌细胞的作用方式及作用机制,我们首先将成熟miR-7模拟物(miR-7mimics)、miR-7抑制物(miR-7 inhibitor)或阴性对照(mock)转染至NSCLC细胞来源的A549、H1299细胞。结果发现,过表达miR-7可以显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的增殖,诱导A549、H1299细胞周期阻滞,抑制A549、H1299肿瘤细胞的克隆形成；相反,抑制miR-7的活性可以部分逆转miR-7对肿瘤细胞的负性调控作用。为了进一步研究miR-7对A549、H1299肺癌细胞的迁移能力的影响,我们还构建了has-miR-7-1的慢病毒表达载体(miR-7-GFP-LV),并利用流式细胞仪分选得到has-miR-7-1稳定表达的细胞,transwell小室实验结果发现,过表达miR-7-1可以抑制A549、H1299肺癌细胞的迁移能力。另外,裸鼠成瘤实验也表明,过表达miR-7的A549及H1299肺癌细胞其肿瘤形成率低,肿瘤体积小,较对照组具有显著性差异。因此,本部分研究结果表明,miR-7在NSCLC组织细胞中表达水平通常较低,miR-7对非小细胞肺癌的生长起负性调控作用,过表达miR-7不仅可以抑制NSCLC来源的肿瘤细胞生长,而且还可以降低裸鼠中NSCLC来源细胞的肿瘤形成率。第二部分microRNA-7靶向负性调控PSME3的表达及机制为了研究miR-7对非小细胞肺癌细胞的作用机制,我们利用生物信息学对其可能的靶基因进行科学预测和初筛,结果发现,miR-7潜在靶基因与肿瘤相关的细胞信号通路主要包括：泛素介导的蛋白质降解,mTOR信号通路以及ErbB通路；PicTar, Target Scan, miRanda等三个数据库信息搜寻及交集运算分析发现了49个miR-7潜在靶基因；这些靶基因中,我们进一步对PSME3, SP1, MNK1, RAF1, SATB1及ATP2B2等六个可能具有癌基因或凋亡抑制基因样作用的潜在靶基因进行分析及实验验证。为了对上述潜在miR-7靶基因进行验证,我们分别构建了这些靶基因的3’UTR结合序列的报告基因载体。双荧光素酶活性实验发现,除ATP2B21基因外,miR-7均可不同程度的抑制其余五个基因的荧光素酶活性；随后的realtimePCR结果显示,miR-7可以同时下调A549及H1299肺癌细胞中PSME3和RAF1基因mRNA水平的表达；Western blot结果进一步发现,A549及H1299肺癌细胞中,miR-7还可以显著下调PSME3蛋白水平的表达。利用targetscan数据库对PSME3基因和miR-7结合序列进行生物信息学分析发现,在人类、灵长类动物、小鼠、牛、马、刺猬甚至大象等物种中,PSME3基因和miR-7的这一结合序列具有高度保守性。为了进一步验证上述研究结果,我们以pGL3-PSME3-3’UTR质粒DNA为模板,利用点诱导突变技术成功构建了针对PSME3-3’UTR与miR-7结合序列的突变体报告基因载体。双荧光素酶报告基因活性检测结果进一步发现,miR-7特异性抑制野生型PSME3-3’UTR载体荧光素酶的活性,而对结合位点发生突变的报告基因载体则无抑制作用。本部分研究结果表明,miR-7可以直接与靶基因PSME3的3’UTR结合,负性调控PSME3基因的表达,PSME3系miR-7新发现的靶基因。第三部分PSME3在非小细胞肺癌中的表达及作用机制基于NSCLC组织细胞中miR-7的表达下调,以及miR-7对PSME3基因的靶向负性调控作用,我们有理由推测,在NSCLC组织中,miR-7的表达与PSME3的表达可能呈负性相关。因此,我们利用realtime PCR技术检测了23对NSCLC组织及其癌旁对照组织中PSME3基因mRNA表达的水平。结果发现,NSCLC组织中PSME3表达较癌旁正常对照组明显上调(p=0.0003)；相反, NSCLC组织中miR-7的表达较癌旁正常对照组显著下调(p=0.0297)。Pearson’s相关性分析结果进一步证实,NSCLC肿瘤组织中miR-7与PSME3的表达呈负性相关(r=-0.3548,p=0.0156)。事实上,相似的实验结果也在NSCLC细胞系A549、H1299、H1355及人正常胚胎肺成纤维细胞系MRC5细胞中得到验证。为了进一步研究PSME3功能蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况,我们还利用组织芯片结合免疫组化技术检测了PSME3在非小细胞肺癌、小细胞肺癌组织及癌旁对照组织的表达情况。结果发现,非小细胞肺癌组织中PSME3蛋白表达较癌旁对照明显上调(p<0.001),同样,小细胞肺癌组织中PSME3蛋白也较对照组织明显上调(p<0.001)；PSME3在非小细胞肺癌组织中的表达水平较小细胞肺癌组织中的要高p=0.003)。统计分析还发现,NSCLC组织中PSME3蛋白表达的强弱与患者的年龄、性别、种族、肿瘤分级和分期未呈现明显相关,但与肿瘤组织体积大小相关(p=0.048)。这些结果提示PSME3表达水平不但和肿瘤进程相关,还可能和肿瘤的组织类型相关。另外,我们还利用western blot检测了23对NSCLC新鲜组织标本中PSME3蛋白的表达水平,结果发现,NSCLC组织中PSME3表达较癌旁对照组表达明显上调；相似的结果也在非小细胞肺癌A549、H1299、H1355以及正常肺成纤维细胞MRC5中得到验证。以上结果表明,PSME3蛋白在非小细胞肺癌组织细胞中高表达,PSME3有可能成为NSCLC辅助诊断的潜在肿瘤标志物。为了研究PSME3基因对NSCLC肿瘤细胞生长的影响及其作用机制,我们利用SiRNA技术将PSME3基因沉默。结果发现,沉默PSME3基因可以抑制肺癌细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞的克隆形成能力,抑制肺癌细胞的迁移；抑制miR-7可上调PSME3的表达,促进H1299细胞增殖,增强H1299细胞的克隆形成能力,促进H1299细胞周期进展；相反,沉默PSME3基因表达则可以部分逆转miR-7抑制物对H1299细胞生长的正性调控作用。上述结果说明,PSME3可以正性调控NSCLC细胞的生长,其表达及作用受miR-7负性调控；沉默PSME3基因对NSCLC肺癌细胞的抑制作用与过表达miR-7的作用类似。p21/WAF1(p21)又称细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制蛋白1,由CDKN1A基因编码,p21是负性调控细胞周期的关键分子。有研究发现,p21蛋白的降解主要通过PSME3依赖及泛素非依赖方式进行。那么,miR-7下调PSME3蛋白的表达,是否可以上调p21蛋白的水平?为了证实这一推论,我们分别将成熟miR-7模拟物及其对照序列,miR-7抑制序列,或/和PSME3-SiRNA转染至H1299细胞中,western blot分析发现,miR-7可以上调p21蛋白水平,其作用和沉默PSME3基因的效应相似；相反,抑制miR-7可以下调p21蛋白的表达水平,而PSME3-SiRNA则可部分逆转miR-7抑制序列所引起的p21蛋白表达水平的改变。因此,在H1299细胞中,miR-7可通过靶向抑制PSME3基因的表达,继而上调p21蛋白表达水平。细胞周期的维持是细胞周期素依赖性蛋白激酶及其抑制蛋白相互制约、相互平衡的结果。其中C-MYC和Cyclin D1是正性调控细胞周期的主要蛋白,miR-7靶向负性调控PSME3基因表达,诱导细胞周期阻滞,其过程是否伴有Cyclin D1和C-MYC基因表达的变化?我们的研究同时发现,miR-7和PSME3-SiRNA可以明显下调Cyclin D1和C-MYC基因的表达,且miR-7的下调作用较PSME3-SiRNA作用明显。以上结果表明,H1299细胞中,miR-7可以靶向负性调控PSME3基因表达,直接或间接引起Cyclin D1和C-MYC表达下调,继而与上调表达的p21蛋白一道,可能共同参与了miR-7靶向负性调控PSME3基因所诱导的细胞周期阻滞过程。综上所述,我们首次发现：miR-7在NSCLC组织表达明显下调；PSME3作为新发现的miR-7靶基因,其表达受miR-7靶向负性调控；miR-7表达与PSME3表达存在负性相关,NSCLC组织中,PSME3基因的高表达可能和miR-7低水平表达调控密切相关。miR-7不但可以在体外抑制非小细胞肺癌细胞的生长,还可抑制其在裸鼠体内的肿瘤形成。同样,沉默PSME3基因可以诱导出类似miR-7对NSCLC细胞的作用；另外,miR-7可以通过负性调控PSME3的表达,影响细胞周期相关蛋白p21基因、C-MYC以及Cyclin D1基因的表达,进而诱导胞周期阻滞,负性调节NSCLC肿瘤细胞的生长。因此,我们的研究结果提示miR-7与PSME3一道可望成为NSCLC潜在的治疗干预靶点,如果针对此二靶点进行靶向治疗药物研发,可能具有潜在的临床应用价值。