目的:应用网络药理学方法和分子对接技术,建立刺槐素（Acacetin,ACA）改善人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在高糖（HG）应激诱导血管内皮胰岛素抵抗（IR）的“药物-疾病-靶点”网络,预测ACA作用的靶点及相应的信号通路;然后在细胞和分子水平验证ACA改善HG诱导血管内皮IR的作用并探究其作用机制,为临床ACA防治糖尿病血管并发症提供实验依据。方法:1、网络药理学和分子对接分析通过有机小分子生物活性数据库（Pubchem）获取刺槐素活性成分的简化分子线性输入规范（smiles）号、刺槐素3D结构文件并分别导入Swisstarget和Targetnet数据库,进行刺槐素活性成分靶点预测,将数据库收集到的各个靶点经Uniprot规范去重汇总,关键词为“insulin resistance”,在Genecards、OMIM、TTD等数据库中对疾病靶点的筛选并整理,删除结果中的重复数据,得到IR相关靶点数据集,接着将药物的预测靶点与疾病靶点输入Venny数据库比对并取交集,结果上传String在线软件,限定研究物种设置为人类,获得PPI网络图,然后运用Cytoscape3.8.0对其进行美化分析,运用Cytoscape3.8.0软件工具Cyto Hubba计算获得PPI网络图的拓扑参数,以线相连蛋白之间有调控作用的网络节点,利用R语言中的ggplot2、Stringr、cluster Profiler、org.Hs.eg.db等R包,进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析,物种选择人类（Homo sapiens）;最后利用Autodocksuite-4.2.6分子对接工具对关键靶标与活性成分小分子进行分子对接验证,对接完成后,依据对接计算结果,评价活性小分子与靶点之间的结合活性。2、细胞实验通过前期网络分析结果确定ACA作用分子靶点后,我们接着通过一系列细胞实验对ACA改善血管内皮IR的作用及机制进行进一步验证。首先成功建立HUVECs胰岛素抵抗模型,检测细胞培养上清液中一氧化氮（NO）、内皮素1（ET-1）的水平以及细胞的胰岛素信号通路中关键信号分子AKT-p S473的表达水平来验证IR模型是否成功建立。接着为了进一步排除ACA处理可能会使HUVECs产生细胞毒性,我们采用细胞计数检测法（Cell Counting Kit 8,CCK8）筛选出安全的药物处理浓度范围。确定药物作用的安全范围之后,接下来我们采用不同浓度的ACA处理HUVECs,验证ACA是否具有改善IR的作用。实验随机分为6组,对照（control,Ctrl）组、高糖（high glucose,HG）组、HG+5ACA（ACA浓度为5μM）组、HG+10ACA（ACA浓度为10μM）组、HG+20ACA（ACA浓度为20μM）组、HG+罗格列酮（HG+RG,RG浓度为5μM）组,按照实验分组处理完细胞后收集各组细胞培养基的上清液,检查各组的NO和ET-1水平检测ACA处理对高糖诱导IR的作用;Western blotting检测各组细胞e NOS-p S1177、e NOS、AKT-p S473、AKT蛋白表达,并比较各组e NOS-p S1177和e NOS比值（e NOS-p S1177/e NOS）,AKT-p S473和AKT比值（AKT-p S473/AKT）的改变,检测ACA处理对胰岛素信号通路蛋白表达和激活的影响。确定ACA具有改善高糖诱导细胞IR后,为了进一步验证其机制,我们进一步将细胞随机分为Ctrl组、Ctrl+ACA（ACA浓度为20μM）组、HG组、HG+ACA组4组,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平,ELISA检测上清液中TNF-α水平,Western blotting检测各组细胞IKKα/β-p S176、IKKα/β、NF-κB-P65蛋白表达水平。为了进一步探讨细胞在IR的状态下ACA是否会影响TNF-α的转录活性,我们进一步将各组细胞又随机分为2个亚组,即Ctrl+NC（Negative control）组和Ctrl+RELA组,Ctrl+ACA+NC组和Ctrl+ACA+RELA组,HG+NC组和HG+RELA组,HG+ACA+NC组和HG+ACA+RELA组。将各组细胞转染质粒后进行荧光素酶报告基因的分析检测ACA对NF-κB转录活性的影响。结果:1、网络药理学和分子对接分析（1）经Swisstarget数据库预测得100个药物作用靶点,Targetnet数据库预测得623个药物作用靶点,并整理文献已报道的靶点,合并去重得靶点122个。（2）经Genecards数据库预测得8633个疾病靶点,OMIM数据库预测得314个疾病靶点,TTD数据库未搜索到。并整理文献已报道的靶点,合并去重得靶点8995个。（3）将潜在活性成分的预测靶点与疾病靶点输入Venny数据库比对并取交集,获得刺槐素抗胰岛素抵抗的102个靶点数据集。（4）获得PPI网络并运用Cytoscape3.8.0美化分析,其中TNFα的Degree值最高,为41。（5）分子对接结果为-4.25。2、细胞实验（1）Western blotting及ELISA结果显示,与Ctrl组相比,HG组的NO水平和AKT-p S473的表达水平显著降低（P＜0.05）,而ET-1水平显著升高（P＜0.05）,表明IR模型建立成功。（2）CCK8结果显示,5～20μM ACA处理细胞24 h后,ACA未呈现出显著的细胞毒性。（3）与Ctrl组相比,HG组的NO水平减少（P＜0.05）,ET-1水平升高（P＜0.001）;与HG组相比,HG+5μM组、HG+10μM组的NO水平没有明显变化,但是HG+20μM组和HG+RG组、的NO水平显著增高（P＜0.05）,所有各组ET-1水平均显著降低,并且呈现出明显的量效关系,表明ACA呈浓度依赖性地改善高糖诱导IR效果。（4）与Ctrl组相比,HG组的e NOS-p S1177/e NOS和AKT-p S473/AKT显著降低（P＜0.05）;经ACA和RG处理后,与HG组比较,ACA各组以及RG组的e NOS-p S1177/e NOS和AKT-p S473/AKT均出现显著升高,其中HG+20组作用最显著（P＜0.01）且与RG组作用相当;该结果进一步表明,ACA可改善高糖诱导的IR,并呈现出较好的量效关系。（5）Ctrl组和Ctrl+ACA组的细胞ROS水平没有明显的差异（P＞0.05）,表明ACA本身并不引起氧化应激;对比Ctrl组,HG组和HG+ACA组的细胞ROS水平显著增加（P＜0.01）,说明高糖可引起细胞产生氧化应激反应;但有趣的是,HG组和HG+ACA组之间的ROS水平也无显著性差异,表明ACA改善IR的效应不是通过拮抗细胞氧化应激来实现的。（6）从TNF-α水平得知,与Ctrl组相比,Ctrl+ACA组TNF-α水平没有显著性差异,而HG组的TNF-α水平升高（P＜0.001）;与HG组相比,跟HG+ACA组的TNF-α水平显著降低（P＜0.01）。表明ACA可能是通过减少上清液中TNF-α水平来改善HG引起的IR。（7）Western blotting结果显示,各组间的IKKα/β和总NF-κB-P65水平均没有显著性差异,说明HG和ACA对IKKα/β和总NF-κB表达无明显影响;但是,跟Ctrl组相比,Ctrl+ACA组IKKα/β-p S176与IKKα/β比值没有明显变化,说明在正常生理情况下,ACA本身并不激活IKKα/β;但HG组的IKKα/β-p S176与IKKα/β比值显著增加（P＜0.001）,说明HG可激活炎症通路;与HG组相比,HG+ACA的IKKα/β-p S176与IKKα/β比值显著下降（P＜0.01）,说明ACA可对抗HG所诱导的炎症通路的激活。接着我们进一步提取了各组细胞的核蛋白行Western blotting检测,结果显示,跟Ctrl组相比,Ctrl+ACA组NF-κB-P65的核蛋白水平没有明显变化,HG组的NF-κB-P65的核蛋白水平增加（P＜0.05）,说明高糖激活炎症通路后可促使NF-κB-P65入核;跟HG组相比,HG+ACA的NF-κB-P65的核蛋白水平显著下降（P＜0.05）,表明ACA可对抗HG诱导的IKKα/β激活及随后的NF-κB-P65入核。以上结果表明,ACA可以通过抑制炎症通路蛋白的激活而不是抑制其表达来改善IR。（8）荧光素酶报告基因检测结果显示,HG+RELA组NF-κB转录活性比的Ctrl+RELA组和Ctrl+ACA+RELA组显著增强,说明HG可升高NF-κB转录活性;与HG+RELA组相比,HG+ACA+RELA组的NF-κB转录活性显著降低,表明ACA可以抑制HG诱导的NF-κB转录活性的异常升高,从而降低炎症反应。结论:网络药理学和分子对接技术预测了ACA作用的潜在靶点TNF-α,信号通路为IKKα/β-NF-κB;（2）细胞实验验证并阐明了ACA可通过抑制HG诱导的NF-κB入核和转录活性的异常升高,降低TNF-α水平以此改善HG诱导IR。