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目的肿瘤细胞耐药性的获得与肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增加有关。最近研究表明,膜联蛋白Annexin A2(Anxa2)可能是联系肿瘤耐药性与侵袭性的关键蛋白分子。许多癌组织中Anxa2的高表达往往伴随着肿瘤转移能力的增加;而且耐药的肿瘤细胞与亲本非耐药细胞相比,Axna2的表达水平更高。众所周知,Axna2活性受第23位酪氨酸(Tyr23)磷酸化的调控,但是目前调控Tyr23磷酸化的详细机制以及Anxa2的磷酸化是否与耐药细胞转移能力的增强有关,目前尚未可知。因此,深入研究Anxa2酪氨酸磷酸化的调控机制,将为转移性肿瘤,特别是耐药肿瘤的临床治疗提供指导意义。本研究中,我们以乳腺癌耐药细胞为模型,通过相关的体外细胞实验以及体内肺转移瘤模型,明确Tyr23磷酸化的Anxa2对肿瘤耐药细胞转移能力的影响,以及调控Tyr23磷酸化可能的分子机制,为耐药肿瘤的临床治疗提供实验依据。方法1.在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR和MDA-MB-468/EPR中,利用siRNA技术,下调Rack1蛋白的表达,通过transwell实验(细胞趋化实验)观察Rack1蛋白对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移能力的影响。2.在上述乳腺癌耐药细胞中,利用siRNA技术,下调Rack1蛋白的表达,Westernblotting分析Rack1表达水平对Anxa2磷酸化的影响。3.在上述乳腺癌耐药细胞中,利用siRNA技术,下调Axna2蛋白的表达,利用transwell实验(细胞趋化实验)观察Axna2蛋白对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移能力的影响。4.利用siRNA技术,下调乳腺癌耐药细胞Src蛋白的表达,利用transwell实验(细胞趋化实验)观察Src蛋白对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移能力的影响。5.在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR和MDA-MB-468/EPR中,分别敲减Rack1,Src和Anxa2,然后利用免疫共沉淀实验技术,分析Rack1表达水平下调对Src和Axna2相互作用的影响;分析敲减Src的表达对Rack1和Axna2的蛋白相互作用的影响;以及Axna2表达水平下调对Rack1和Src的相互作用的影响。6.分别构建带Flag标签的Rack1WT质粒以及突变体Rack1Y246F质粒(突变后不能与Src相互作用),经病毒包装后感染稳定敲减Rack1的MCF-7/ADR细胞,通过Western blotting分析回补效果,回补后的各组细胞分别用transwell实验和细胞划痕实验观察乳腺癌耐药细胞侵袭迁移能力的变化。7.分别构建带GFP标签的Anxa2WT以及突变体质粒:Anxa2Y23A(模拟持续非磷酸化)和Anxa2Y23D(模拟持续磷酸化),经病毒包装后感染稳定敲减Rack1的MCF-7/ADR细胞,通过Western blotting分析过表达效果,利用transwell实验和细胞划痕实验观察乳腺癌耐药细胞侵袭迁移能力的变化。8.构建NOD-SCID小鼠肺转移模型,将MCF-7/ADR细胞,稳定敲减Rack1的MCF-7/ADR细胞,以及回补Rack1WT-Flag、Rack1Y246F-Flag及其对照组细胞,通过尾静脉注射到小鼠体内,观察肺部转移瘤情况,通过苏木素/伊红染色,显微镜观察各组小鼠肺转移瘤数目。结果1.在乳腺瘤耐药细胞MCF-7/ADR和MDA-MB-468/EPR中,下调Rack1蛋白水平后,细胞的侵袭迁移能力明显降低。2.下调乳腺瘤耐药细胞中Rack1蛋白表达水平后,Anxa2的磷酸化蛋白水平下降。3.在乳腺瘤耐药细胞中,下调Anxa2蛋白水平后,细胞的侵袭迁移能力降低。4.在乳腺瘤耐药细胞中,下调Src蛋白水平后,细胞的侵袭迁移能力降低。5.在乳腺瘤耐药细胞中,下调Rack1蛋白水平后,Src和Anxa2的相互作用明显减弱;下调Axna2蛋白水平后,Rack1和Src相互作用水平没有变化;下调Src蛋白水平后,Rack1和Axna2相互作用水平没有恢复。6.通过Western blotting检测Rack1和Flag的表达,确定外源性的Rack1表达水平接近Rack1的本底水平,拯救效果较为理想。并且,敲减Rack1组细胞的迁移侵袭能力受到抑制,经Rack1WT-Flag拯救后,肿瘤细胞的迁移侵袭能力得到恢复;而Rack1Y246F-Flag拯救并不能恢复肿瘤的迁移侵袭能力。7.Western blotting检测Anxa2和GFP的表达,证明外源性Anxa2的表达水平接近内源性Anxa2的表达水平。敲减Rack1后减弱了细胞的迁移侵袭能力,过表达Anxa2WT-GFP和Anxa2Y23D-GFP后,可恢复肿瘤细胞的迁移侵袭能力,并且过表达Anxa2Y23D-GFP组细胞的迁移侵袭能力更强,而Anxa2Y23A-GFP和对照组拯救的细胞不能恢复肿瘤的迁移侵袭能力。8.NOD-SCID小鼠肺转移模型中,解剖观察到MCF-7/ADR组和Rack1WT-Flag拯救组小鼠肺表面有更多的转移灶。H&E染色证明,与对照组相比,敲减Rack1的表达或者转入突变体Rack1Y246F-Flag不能恢复Anxa2的磷酸化,均能抑制耐药细胞的肺转移,经Rack1WT-Flag拯救后会增加耐药细胞的转移能力。结论Anxa2 Tyr23的磷酸化能够促进耐药肿瘤细胞的迁移侵袭能力。Rack1通过介导Src与Anxa2的相互作用,促进Src对Anxa2的磷酸化,从而促进耐药细胞的迁移侵袭能力增加。在耐药细胞中敲减Rack1的表达或者抑制Anxa2的磷酸化,可以减弱耐药细胞的肺转移。Rack1和Anxa2可能成为耐药肿瘤细胞治疗的潜在分子靶点,该研究可为临床耐药肿瘤的治疗提供指导意义。