沙门氏菌（Salmonella）是全世界面临挑战的传染性人畜共患病原菌,主要通过消化道感染,主要存在于宿主肠道,可引起腹泻、呕吐等疾病,至今已发现沙门氏菌包含2600多种血清型,不仅给养殖业带来较大损失,还对人类健康和全球公共卫生构成一定威胁。准确而快速的沙门氏菌诊断方法,是防止该病的关键。沙门氏菌Peg菌毛通过介导细菌与宿主黏附定植的互作,作为影响沙门氏菌致病性的重要黏附定植因子存在于D群沙门氏菌如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型中,而上述三种病原菌严重影响家禽业的发展;鉴于展呈Peg菌毛后细菌自身的颗粒抗原性,使其有望成为检测沙门氏菌的潜在靶标。单克隆抗体由于其特异性强、纯度高、均一性好等优点,在病原检测和疾病诊断方面显示出极大的优势。传统单克隆抗体制备程序较为繁琐,本研究旨在以一种简便快捷的方式制备抗沙门氏菌Peg菌毛蛋白的单克隆抗体,并建立可检测鸡白痢沙门氏菌的玻板凝集方法。具体内容如下:1.抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体的简捷制备方法为研发沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体,本研究首次利用实验室构建的一种S9H-Peg靶标抗原重组菌株（其中S9H是一种泛性惰性载体菌株,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCCNo.2091）作为免疫原,调整浓度至5×109 cfu/mL对6周龄BALB/c小鼠进行免疫,不需添加任何佐剂,剂量100μL/只,共免疫4次,每次间隔10 d。选取凝集抗体效价最高的3只小鼠,利用鼠杂交瘤细胞融合技术,获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。以S9H-Peg为阳性对照,以S9H作为阴性对照,通过玻板凝集试验技术筛选出能够产生特异性抗Peg菌毛单克隆抗体的5 株杂交瘤细胞,分别为:72-Ⅰ-F8、97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、112-Ⅱ-F5、152-Ⅰ-D4。连续传代40代,测试杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性,最终获得3株稳定分泌抗Peg菌毛单克隆抗体杂交瘤细胞,其细胞上清凝集效价经检测均可稳定在1:2,依次命名为:97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、152-Ⅰ-D4。分别制备小鼠腹水,并纯化。对三株单克隆抗体的特性进行测定包括:（1）抗体亚类测试,结果显示,三株单抗均为IgG2b/κ链;（2）抗体效价测定,玻板凝集法（S9H-Peg菌株作为凝集抗原,浓度为:5×109 cfu/mL）检测,结果显示,3株单克隆抗体效价分别为1:320、1:160和1:320;（3）特异性检测:①采用玻板凝集方法,利用实验室前期构建的,11种携带靶标抗原（包括沙门氏菌菌毛Peg、沙门氏菌菌毛Sef14、沙门氏菌菌毛Saf、沙门氏菌菌毛SipD、沙门氏菌Ⅰ型菌毛、大肠杆菌菌毛K88ac、大肠杆菌菌毛K99、大肠杆菌菌毛987P、大肠杆菌菌毛F18ab、大肠杆菌菌毛F18ac和大肠杆菌菌毛Sfm）的惰性载体菌株,对单克隆抗体的特异性进行验证。结果显示,三株单克隆抗体,都能够与Peg靶标（携带Peg菌毛的S9H-Peg）发生特异性凝集反应,而不与10种携带其他靶标抗原发生特异性凝集反应,与阴性对照菌株S9H（不携带Peg菌毛）也不发生凝集反应,显示了高度的特异性。②间接免疫荧光试验中,将所制备的单克隆抗体作为一抗,以羊抗鼠IgG-HRP为二抗,分别与S9H-Peg和S9H菌株对照共孵育,在荧光显微下观察,结果显示,制备的单抗能够特异性识别并结合S9H-Peg菌株,能够观察到菌体发绿色荧光;而不与S9H菌株对照结合,观察不到荧光。③Western blot分析显示,制备的单克隆抗体与表达Peg菌毛的阳性菌株（S9H-Peg）发生特异性反应,单克隆抗体可识别Peg菌毛的主要亚单位蛋白PegA,在20kDa处出现特异性条带;而与对照菌株S9H不发生反应,无特异性条带产生。本研究采用简捷方法成功制备了针对沙门氏菌Peg菌毛的单克隆抗体,该方法的简捷性主要体现在以下几个方面:（1）免疫原制备的简便（无需进行抗原的抽提或原核表达与蛋白纯化等复杂过程）;（2）免疫程序简单、耗时短,且无需佐剂;（3）抗体筛选过程方便快捷（仅需进行玻板凝集测试,而无需进行ELISA检测等复杂流程）。一定程度的简化了单克隆抗体的制备流程,减少了工作量,提高了单克隆抗体的制备效率。2.鸡白痢沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立和初步应用上一章研究中成功获得了三种针对沙门氏菌Peg菌毛的单克隆抗体,经测试,三株单抗均具有玻板凝集特性,且前期试验表明,三株单抗叠加使用由于靶标抗原多个结合决定族,可以使抗原抗体结合更充分,提高反应敏感性,所以效果优于单独使用。基于上述试验背景,本章利用第一章制备的三株单克隆抗体（97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、152-I-D4）,经稀释1:100倍,混合后建立了鸡白痢沙门氏菌玻板凝集方法。首先,对建立方法的敏感性进行测试,结果显示,该方法对鸡白痢沙门氏菌NCTC5776纯培养物的检出限为104cfu/反应。其次,对所建立检测方法的特异性进行验证,通过玻板凝集试验,利用表达Peg菌毛的沙门氏菌（包括:鸡白痢沙门氏菌NCTC5776、鸡白痢沙门氏菌ATCC700623）、不表达Peg菌毛的沙门氏菌（包括:鼠伤寒沙门氏菌STM 43-3、鼠伤寒沙门氏菌W32、圣保罗沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌36、猪霍乱沙门氏菌29、猪霍乱沙门氏菌U80、田纳西沙门氏菌）以及非沙门氏菌（包括:大肠杆菌APEC TW-XM、大肠杆菌ETEC C83901、大肠杆菌ETEC C83902、大肠杆菌ETEC C83903、大肠杆菌ETEC987P、大肠杆菌ETEC987P、大肠杆菌ETEC987P-X进行测试）,结果显示,该方法能够特异性检测表达Peg菌毛的沙门氏菌,而与不表达Peg菌毛的沙门氏菌及非沙门氏菌不存在任何交叉反应,特异性好。接着,进一步对该方法的临床应用进行了初步探索:（1）对模拟污染无菌饮用水的检测,向样品中人工污染不同浓度的沙门氏菌,再用所构建的方法进行检测,结果显示,当样品中污染量为102cfu/mL时,即可在预增菌后通过本方法检出鸡白痢沙门氏菌;（2）对模拟污染鸡饲料样品的检测,向无菌无抗生素的饲料样品中添加鸡白痢沙门氏菌NCTC5776单细菌。增菌后,对模拟污染的饲料进行检测,结果显示,经10小时增菌,该方法能够检测出饲料中的鸡白痢沙门氏菌污染,敏感度为4×104cfu/反应;（3）对临床疑似鸡白痢沙门氏菌感染的18只病鸡进行剖检病检测,无菌环境下研磨病灶脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胆囊）制备样品,分别用传统方法和本研究构建的方法对样品中的沙门氏菌进行检测。结果表明,经过预增菌过程,应用建立的玻板凝集方法,从18份样品中共检出5份鸡白痢沙门氏菌阳性样品,经传统分离鉴定方法复检,二者结果相符。此外,传统分离鉴定方法过程较为繁琐,而本方法仅需对样品进行前增菌,即可用于检测,且玻板凝集反应仅需2min即可得到结果,方便快捷。显示了本方法良好的实用性。综上,利用实验室构建的S9H-Peg靶标抗原重组菌株,建立了一种单克隆抗体制备的简捷方法,该方法在抗原准备、免疫程序以及杂交瘤细胞筛选方面,均显示了极大的简便性。利用该方法,成功制备出3株针对沙门氏菌Peg菌毛的特异性凝集性单克隆抗体。此外,以三株单抗作为检测抗体,利用玻板凝集的方式建立鸡白痢沙门氏菌的快速检测方法,该方法特异性强、敏感度高。而后进行了人工模拟污染样品检测和临床样品检测,比较传统国标检测方法,新建立的方法能够实现对鸡白痢沙门氏菌的快速、准确检测。本研究提供了将携带外源抗原（Peg）的惰性载体应用于单克隆抗体制备与筛选的成功案例,为单克隆抗体的制备策略提供了新的思路与现实依据。同时,为以Peg菌毛为靶标的鸡白痢沙门氏菌诊断技术提供了物质材料与试验基础。