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甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤,其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势。手术、甲状腺激素和放射性碘疗法均可以治愈大多数分化型甲状腺癌,但对未分化型甲状腺癌无效。Sonic Hedgehog（Shh）信号通路及其下游的Gli1转录因子在肿瘤发生过程中起着重要作用,该通路也是肿瘤治疗的重要分子靶点。本实验室前期工作发现,Shh信号通路在甲状腺癌中被高度激活;该通路促进甲状腺癌细胞的生长增殖和侵袭转移;促进甲状腺肿瘤干细胞的自我更新。Shh信号通路抑制剂已用于临床治疗髓母细胞瘤和皮肤基底细胞癌,但本实验室的研究发现Gli1抑制剂GANT61抑制甲状腺癌的效果并不理想,其分子机制至今仍未阐明。自噬是真核细胞中高度保守的分解代谢过程。当细胞发生自噬时,胞浆内容物和受损细胞器被包裹在双层膜内形成自噬小体,与溶酶体融合后被溶酶体内的蛋白水解酶降解,降解产生的氨基酸可用于能量再生和蛋白合成。腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）是一个能量感受器,其活性主要受胞浆内AMP/ATP水平调控。另外,转化生长因子激酶1（TGF-activated kinasel,TAK1）亦能激活 AMPK。AMPK 通过磷酸化 ULK1S555 位点,来活化ULK1,从而激活自噬通路。JNK（c-Jun N-terminal kinase,JNK）是细胞应激过程中激活的一种丝氨酸/苏氨酸激酶。JNK通过磷酸化Bcl-2,促进Beclin1/Bcl-2复合物的解离,解离后的Beclin1参与细胞自噬过程。另外,JNK亦能激活下游的转录因子诱导LC3基因表达。自噬在肿瘤的发生发展过程中具有双重作用。自噬激活可诱导肿瘤细胞发生死亡,也能为肿瘤细胞提供能量,从而促进其存活。同时,也能降低药物对细胞的毒性作用,降低药效。自噬抑制剂可用于提高肿瘤细胞对化疗放疗的敏感性。本论文旨在探究Shh信号通路抑制剂GANT61是否诱导甲状腺肿瘤细胞发生自噬,是否通过诱导自噬降低Gli1抑制剂的抗肿瘤活性。本论文将阐明Shh信号通路抑制剂GANT61诱导自噬发生的分子机制。SW1736细胞是未分化型甲状腺癌细胞系。为了研究抑制Gli1是否能诱导SW1736细胞发生自噬,我们用Gli1 siRNA转染细胞。免疫印迹法（Western blot）结果分析显示,抑制Glil,会引起胞内LC3和p62蛋白表达水平显著上调。而Gli1过表达,结果相反。Gli1抑制剂GANT61和Smo抑制剂Cyclopamine处理SW1736细胞,导致LC3和p62表达水平呈时间和剂量依赖性的增加。我们进一步研究GANT61诱导细胞自噬的分子机制。结果显示,GANT61处理细胞导致TAK1、AMPK、ULK1S555、ACC、JNK磷酸化水平呈时间和剂量依赖性上调。Gli1敲除的到同样的结果。AMPK抑制剂CompoundC（CC）能够阻断GANT61诱导的AMPK、ULK1s555、ACC磷酸化上调,同时阻断p62表达和LC3脂化。荧光共聚焦显微镜分析发现,GANT61单独处理细胞导致自噬小体数量明显增加,而CC则明显阻断GANT61诱导的自噬小体的数量增加。JNK抑制剂SP-600125阻断GANT61诱导的JNK磷酸化,阻断了 GANT61上调的LC3和p62蛋白表达水平,阻断了 GANT61诱导的自噬小体的数量增加。本实验室的前期研究结果发现,TAK1是AMPK和JNK上游的一个激酶。在此我们研究了 GANT61是否通过激活TAK1来激活下游的AMPK和JNK来调控细胞自噬。结果显示,TAK1 抑制剂 5Z-7-oxozeaenol（5Z）抑制 GANT61 上调的 TAK1、JNK、AMPK、ULK1S555、ACC磷酸化。同时,抑制GANT61诱导的LC3和p62蛋白水平的增加。用TAK1siRNA敲除TAK1也得到类似的结果。荧光共聚焦观察发现,5Z与GANT61共处理细胞,自噬小体数量明显低于GANT61单独处理组。接下来,我们探讨GANT61诱导的自噬是否可进一步增强GANT61诱导的凋亡。结果表明,GANT61诱导Caspase-3（C3）和Caspase-8（C8）增加呈剂量和时间依赖性,但对PARP的诱导与剂量无关。氯喹、5Z和TAK1 siRNA抑制自噬增强了 GANT61诱导的Caspase8和PARP的切割比caspase-3更明显。最后,我们研究了 GANT61诱导的自噬对细胞增殖的影响。通过细胞活力试剂盒检测细胞活力发现,GANT61可呈剂量依赖性抑制细胞增殖。自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）、5Z与GANT61共同处理与单独用CQ或5Z相比对细胞增殖具有明显的抑制作用。综上所述,在两个未分化型甲状腺癌细胞系中,抑制Shh通路激活TAK1-AMPK通路。TAK1激活可诱导其两个下游底物AMPK和JNK的磷酸化。甲状腺肿瘤细胞自噬中AMPK和JNK的激活参与了 GANT61诱导的自噬。抑制自噬可增强GANT61诱导的细胞凋亡和抗增殖活性。本研究明确了 Shh抑制剂诱导自噬的分子机制,为改善Shh抑制剂治疗甲状腺癌提供新的思路和理论基础。