腾冲嗜热厌氧杆菌(T.tengcongensis)是我国自主分离并完成全基因组序列测定的第一个原核微生物。该菌具有一些有趣的特征,如它生长在70℃左右但GC含量较低(33％)；革兰氏染色阴性但基因组序列里含有革兰氏阳性细菌的特征基因；另外,该菌86.7％的基因分布在复制前导链上。更独特的是,该菌基因组编码有两个DnaG引发酶,不同于常规的一个细菌基因组只编码一个DnaG引发酶。本论文对这两个DnaG蛋白的生化性质和作用机制展开了精细比较研究,揭示了这两个蛋白的共性和特性及蛋白对高温环境的可能适应机制,进而推测了其各自可能参与的重要生命过程。另外,本论文还对腾冲嗜热厌氧杆菌编码的反向旋转酶(高温微生物所特有的蛋白)展开了系统研究,进而揭示了该蛋白中四个假定的DNA结合区域在反向旋转酶活性的各个方面所起的不同作用。　　 DNA引发酶能够在单链。DNA模板上合成短的RNA引物,从而起始先导链和后随链上的DNA合成,在DNA复制过程中起着很重要的作用。细菌引发酶由dnaG基因编码,一般一个细菌染色体上只有一个dnaG基因。腾冲嗜热厌氧杆菌全基因组信息分析发现,该菌基因组有两个dnaG基因。这种基因组内同时编码两个DnaG蛋白的现象在该菌所在的厚壁菌门中广泛存在。因此,对腾冲嗜热厌氧杆菌中这两个DnaG蛋白活性及功能的研究可能具有代表性的意义。体外研究发现,这两个蛋白TtDnaG(600个氨基酸组成)和TtDnaG2(358个氨基酸组成)均具有引发酶活性,能在一个很宽的温度范围内合成短片段RNA引物。TtDnaG2蛋白的引物合成能力总是强于TtDnaG蛋白。这两个蛋白的模板识别特异性有显著差异。TtDnaG有其特异识别的核苷酸序列:在64种三核苷酸序列中,它仅特异性地识别5-CCC-3’；当5-CCC-3’再紧邻一个G或C,能更有效地被TtDnaG识别；更独特的是,它对只有G,C组成的四核苷酸序列有着明显的识别偏好性。这种GC组成的四核苷酸特异识别偏好性为我们首次报道,且这种识别序列的组成方式可能是嗜热微生物来源的引发酶在复制起始过程中对热适应的一种机制。相反地,TtDnaG2蛋白无明显的模板识别特异性,它能利用所有被检测的模板合成RNA产物,且其RNA产物通常很长,甚至长于模板。这些非常规的活性均暗示TtDnaG2蛋白可能不是DNA复制引发酶,而可能具有其它未知的重要功能。模板结合亲和力实验表明TtDnaG2蛋白的模板结合能力是TtDnaG蛋白的10倍左右,这种高模板结合能力可能与它的低模板特异性、高引物合成活性等相关。本研究为引发酶结构和功能的多样性提供了全新的理解和认识。　　 反向旋转酶(Reverse Gyrase)是一个独特的TypeⅠA DNA拓扑异构酶,它能利用ATP水解的能力在DNA分子中引入正超螺旋,是迄今为止发现的唯一一个具有正超螺旋活性的拓扑异构酶。它几乎存在于所有极端嗜热微生物(最适生长温度超过80℃)及部分嗜热微生物(最适生长温度在65-80℃)。作为生长在高温环境下的生命的一个特征性的蛋白分子,反向旋转酶对其高温环境下的适应性有着很重要的作用。腾冲嗜热杆菌也编码一个反向旋转酶(TtRG蛋白),它的基本生化活性与之前报道的反向旋转酶类似:只在高于50℃温度下具有活性,且其正超螺旋活性是严格ATP依赖的；位点特异性突变实验表明864位的酪氨酸残基为其重要的活性位点。同源蛋白的晶体结构预测了四个可能的DNA结合区域,为了研究这些区域的功能,我们将TtRG蛋白中这四个相应的区域(分别是N端zinc-finger区域,β-hairpin区域,“latch”区域以及C端zinc-finger区域)--进行突变,构建了四个突变蛋白。通过仔细比较这四个突变蛋白与野生型蛋白在DNA超螺旋活性,蛋白热稳定性,DNA结合活性以及ATP水解活性等反向旋转酶相关活性方面的差异,我们发现:这四个区域中,除了“latch”区域外,均可能直接参与了与DNA的结合；-N,C两端的zinc-finger区域突变后,严重影响了TtRG突变蛋白高温下的热稳定性,表明这两个区域对TtRG蛋白热稳定性的维持有重要作用；β-hairpin和“latch”区域突变后,蛋白的ATPase活性显著降低,表明这两个区域可能与ATP水解活性有关；DNA结合活性亦或是ATP水解活性的降低,导致这些突变蛋白均丧失了正超螺旋活性。这些突变分析为这四个区域在反向旋转酶活性中所做的贡献提供了全新的认识。