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背景ESE3是ETS转录因子家族的一员,主要表达于上皮组织中,在细胞分化和癌症进展中发挥着很重要的作用[1,2]。而且,多篇研究发现,ESE3在前列腺癌中发挥着抑制肿瘤细胞的生长,增殖,促进细胞凋亡,从而发挥抑制癌症进展的功能[3,4],然而在胰腺癌中尚未有人报道过ESE3在其组织中到底发挥什么样的作用。在前期的实验与工作中我们惊奇的发现与正常的胰腺组织相比,在胰腺导管腺癌中ESE3的表达是降低的,甚至是缺失的。重要的是ESE3在胰腺中的缺失会导致胰腺癌细胞的侵袭转移[5]。因此,在本课题中旨在探讨ESE3与肿瘤免疫逃逸的关系,在免疫逃逸中的作用,明确其调节机制及调控机制;从而从临床病例的资料水平,细胞水平,动物水平来明确ESE3在胰腺癌中的重要作用。方法1.对胰腺导管腺癌组织的标本进行ESE3免疫组化染色,分析ESE3在胰腺癌中与各种生存指标的关系,同时对这些胰腺癌组织标本进行FOXP3的染色,FOXP3阳性的T细胞代表Treg,并进行统计分析ESE3的表达水平与Treg数量在胰腺导管腺癌组织中的关系,与此同时整理患者的临床资料及预后随访,分析胰腺导管腺癌中ESE3和Treg与临床病例各项指标之间的关系。2.体外动物实验,构建PAN02细胞过表达ESE3的稳转细胞系,在具有完整免疫系统的小鼠皮下注射PAN02及其过表达EHF的稳转细胞系,两周后处死小鼠,然后收集瘤体,将瘤体剪碎研磨,收集瘤体细胞,并进行CD4,CD25,FOXP3的染色,流式检测Treg的百分比,对CD8和IFN-γ进行染色,然后分析产生IFN-γ的CD8+T细胞在两组动物体内的比例。3.应用Western blot的方法检测4种胰腺癌细胞系ESE3蛋白的表达水平,并构建两种过表达ESE3的稳转细胞系和两组降表达ESE3的稳转细胞系;用Western blot实验方法检验稳系细胞中EHF的蛋白水平表达量。4.从人源外周血中分选单个核细胞(Peripheral Mononuclear Cells,PBMCs),并用磁珠分选的方法从单个核细胞中分选出Treg的前体细胞(CD4+CD25-T cells)和Treg细胞。将细胞与四种胰腺癌细胞及其四种稳转细胞系共培养,用CFSE的方法验证ESE3在肿瘤细胞中的变化对Treg增殖的作用,将Treg前体细胞即CD4+CD25-T细胞与上述对照组细胞与实验组细胞共培养3-5天,使用流式的方法对共培养的T细胞进行CD4,CD25,FOXP3染色,检测诱导的Treg的比例与ESE3的关系,利用Transwell系统模拟Treg细胞的趋化过程,小室上方放入分选的Treg细胞或者单个核细胞,下室铺胰腺癌细胞系,用流式检测趋化到下室中Treg占单个核细胞的比例,并且与此同时在显微镜下观察并计数趋化到小室中Treg的数量,并统计对照组细胞与稳系之间的不同。5.Western Blot验证胰腺癌细胞中ESE3与TGF-β1在蛋白水平之间的相关性,ELISA实验验证ESE3对TGF-β1分泌量的影响,并用RT-PCR验证在mRNA水平两者之间的关系。6.利用CHIP实验并结合双荧光素酶实验验证ESE3对TGF-β1的调控关系。结果1.ESE3在胰腺癌中的表达水平及与Treg数量的关系。利用免疫组化方法对113例胰腺导管腺癌组织标本进行免疫组化染色,我们根据组化的染色强度与染色面积将ESE3的表达分为低高两级,发现在113例组织中低表达ESE3的例数可以达到81例。与之前我们的实验结果(ESE3在胰腺癌中比癌旁中的表达要少)相一致。根据医学统计软件分析发现ESE3的表达程度与肿瘤的大小,病理分级成负相关,而与患者的年龄,性别没有明确的相关性,并且ESE3高的患者组的生存期明显的高于低表达组。更为重要的是,FOXP3阳性的Treg细胞在胰腺癌组织中的表达也是有差异的,根据FOXP3着色的小的细胞个数的多少将Treg分为低高两级,并且发现在113例组织中Treg数量多的可以达到78例。我们进而研究了胰腺导管腺癌中EHF的表达与FOXP3阳性的Treg细胞数量之间的相关性,结果发现其两者之间呈现明显的负相关(r=-0.522,p<0.001**)。2.动物实验验证ESE3蛋白的表达量与肿瘤组织中Treg数量的关系及ESE3表达水平的不同与肿瘤组织中效应T细胞的关系。在注射EHF高表达稳转细胞系之后的小鼠瘤体中Treg的比例明显低于对照组,在注射EHF降表达的细胞系的小鼠体内Treg的比例明显的高于对照组,同时,在EHF高表达的小鼠瘤体中IFN-γ+的CD8+T细胞比例明显高于对照组,降表达EHF的小鼠中效应T细胞的比例远远的低于其对照组。3.体外共培养系统实验结合流式细胞术的方法验证ESE3表达量导致Treg数量变化的机制.实验结果发现ESE3在胰腺癌细胞中的变化对Treg的趋化方面没有影响,但是ESE3的改变可以影响CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+T细胞转变,而且ESE3在胰腺癌细胞中的变化可以影响Treg细胞的增殖。进而对胰腺癌细胞及其稳系细胞所诱导出的Treg与CD8+T细胞共培养发现ESE3过表达后的细胞所诱导出的Treg对CD8+T细胞的的抑制作用与对照组对比有所下降。4.四种胰腺癌癌细胞的Western blot证实,ESE3的蛋白水平变化和TGF-β1的蛋白表达水平是有关系的,ESE3过表达后TGF-β1的表达量明显的下降;而ESE3降表达后TGF-β1的蛋白水平显著的升高,结合ELISA实验证实,胰腺癌细胞向外释放TGF-β1的水平也和ESE3的表达水平呈负相关;同时免疫组化染色发现在胰腺癌组织中,ESE3与TGF-β1的表达胰腺癌组织中可以共定位,并有明显的负相关性(r=-0.522,P<0.001**)。5.利用PANC-1和293T细胞系,结合ChIP实验发现转录因子EHF可直接结合于TGF-β1的启动子区;同时行双荧光素酶实验证实,过表达EHF后TGF-β1启动子转录活性减弱,而突变上述EHF与TGF-β1结合位点后,其转录活性的减弱即被反转,从而证实EHF可以直接调控TGF-β1的表达。结论1.ESE3/EHF蛋白在胰腺癌组织中是低表达的,并且其表达水平与Treg在胰腺癌组织中的数量成明显的负相关。2.ESE3/EHF直接结合到TGF-β1启动子区的结合位点,调控TGF-β1的转录,翻译。3.ESE3通过抑制TGF-β1的转录及翻译,减少TGF-β1向细胞外释放,并抑制了Treg的诱导转变和增殖,从而使胰腺导管腺癌组织中CD8+IFN-γ+的抑制作用减低,使效应T细胞的数量增多,解除了胰腺癌组织中的免疫逃逸。