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卡拉胶酶是一种具有广泛应用前景的工具酶,主要来源于海洋细菌。全基因组测序结果表明食鹿角菜假交替单胞菌ASY5可能有多种卡拉胶酶基因,目前已确认了其中的2种,其它的序列有待进一步发掘。本研究对食鹿角菜假交替单胞菌ASY5的两种κ-卡拉胶酶基因进行异源分泌表达,并验证新发现的ι-卡拉胶酶的发酵条件,酶学性质和降解产物,这对于卡拉胶酶的大规模制备和卡拉胶寡糖的工业化生产具有重要的意义。研究结果如下:（1）将来源于菌株Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5的κ-卡拉胶酶基因克隆到载体pET-28a上,并在大肠杆菌中表达。克隆得到的κ-卡拉胶酶基因序列全长1194 bp,编码一个由398个氨基酸残基组成的蛋白酶,该蛋白酶的分子量为48 kDa。结构域分析表明该κ-卡拉酶符合GH16家族的特点。对重组κ-卡拉胶酶的酶学性质进行考察:重组κ-卡拉胶酶只能够专一性的降解κ-卡拉胶;该酶的最适温度和pH分别是55°C和pH 9.0,在40°C保温1 h后与对照相比仍保留95.0%的活性,在45°C保温1 h后剩余酶活与为60.0%;在pH 8.0-10.0的缓冲液中处理30 min,仍能保持80%以上的酶活力。由ESI-MS分析可知,P.carrageenovora ASY5κ-卡拉胶酶水解物主要是二糖和少量的四糖。（2）以菌株P.carrageenovora ASY5为研究对象,利用PCR技术获得κ-卡拉胶酶car 30的编码序列,并结合生物信息学方法对car 30序列进行深入分析。同源性分析发现car 30基因的推测氨基酸序列与来自Pseudoalteromonas sp.H103（WP 058549724.1）的假定蛋白质同源性最高,达到100%。二级结构分析表明,car 30编码的蛋白质主要以不规则卷曲,α-螺旋和β-折叠为其基本结构单元。三级结构显示角叉菜胶κ-卡拉胶酶是近似球形的,β结构的蛋白,其表面主要是疏水蛋白的核心结构并且具有典型的GH16家族特征的（即α/β水解酶结构域）。将该基因car 30在Escherichia coli BL21（DE3）中表达,以κ-卡拉胶为底物时重组κ-卡拉胶酶LJ 30的比活力达463.1 U/mg,Km、Vmax和Kcat分别为2.04mmol/L、100.77μmol/（mg·min）和2283.64 s-1。重组κ-卡拉胶酶LJ 30的最适反应温度和pH分别为45°C和pH 6.5,温育在50°C进行30 min,剩余的酶活性高于50.0%,在pH 6.5-7.5的缓冲液中处理60 min,仍然能够维持超过50.0%的酶活性。通过电喷雾离子化质谱（Electrospray Ionization Mass Spectrometry,ESI-MS）,重组κ-卡拉胶酶的最终产物为κ-卡拉二糖和κ-卡拉四糖。（3）以ι-卡拉胶作为诱导剂发酵生产ι-卡拉胶酶,发酵的最佳条件如下:ι-卡拉胶0.9%,酵母粉0.5%,NaCl 15 g/L,培养温度20°C,接种量4%,装液量50 mL,培养时间40 h,培养基的初始pH为7.0。在发酵培养条件下,优化酶活性达到1.24 U/mL,是优化前的2.21倍。在ι-卡拉胶作为诱导物的情况下,菌株ASY5能够同时产生κ-卡拉胶酶和ι-卡拉胶酶。结果表明:ι-卡拉胶酶的最适温度为40°C且在35°C内保温45 min,相对酶活性大于60%,最佳pH值为8.0。利用ESI-MS分析酶解产物,结果表明,源自P.carrageenovora ASY5的ι-卡拉胶酶的水解产物是二糖和四糖。以ι-卡拉胶诱导产生的κ-卡拉胶酶的最适温度为50°C,在30°C-45°C范围内保持45 min能保留50%以上的酶活。该酶的最适pH为9.0,在pH 9.0-11.0范围内酶活可保持95%以上。利用ESI-MS分析酶解产物,结果表明,来源于P.carrageenovora ASY5的κ-卡拉胶酶的酶解产物为二糖。