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具有良好免疫效果和高度生物安全性的马立克氏病(MD)基因工程疫苗及其活载体疫苗,为MD、AIV等禽病的有效预防提供了一种新手段。本文在国内外相关研究的基础上,利用最新的细菌人工染色体(BAC)重组技术,以MDV(GX0101株)及其meq基因为研究对象,开展了下列研究工作。1. MDV(GX0101株)meq基因缺失株的构建及其生物学特性研究:本研究利用BAC重组技术敲除了一株MDV(GX0101株)的meq基因,提取其感染性克隆GX0101Δmeq BAC转染鸡胚成纤维细胞(CEF),间接免疫荧光试验证明meq基因的成功敲除;所拯救的MDV(GX0101株)meq基因缺失株(GX0101Δmeq)可在CEF中进行良好的复制;GX0101与GX0101Δmeq分别感染1日龄SPF鸡试验结果表明,meq基因的缺失导致了GX0101的致病性和致肿瘤性的丧失,说明GX0101Δmeq是一株具有良好安全性的候选疫苗株。2. meq基因与MDV免疫抑制作用相互关系研究:用GX0101与GX0101Δmeq分别感染1日龄SPF鸡,比较感染后SPF鸡相对免疫器官重量、血液中淋巴细胞数与白细胞数、免疫禽流感灭活疫苗与新城疫灭活疫苗后的抗体应答能力以及T淋巴细胞(CD4+/CD8+)的动态变化。结果显示,GX0101所引起的免疫抑制作用由于meq基因的缺失而显著降低。3. GX0101Δmeq的免疫效果评价: 1日龄SPF鸡以2000 PFU/只的剂量腹腔接种GX0101Δmeq和CVI988/Rispens疫苗株,免疫接种后5天,以500 PFU/只的MDV超强毒株vv rMd5进行攻毒,取90天前疑似MD特有病变脏器和90天后所有存活鸡心脏、肝脏、脾脏做病理切片,其保护指数分别为100%和89%。结果表明,GX0101Δmeq可在体外稳定复制,而且能诱导比CVI988/Rispens疫苗株更好的免疫保护效果。4. GX0101Δmeq-BAC感染性克隆的免疫效果: 1日龄SPF鸡分别以10μg /只的剂量大腿肌肉接种GX0101Δmeq-BAC和2000 PFU/只的剂量腹腔接种CVI988/Rispens疫苗株,分别在免疫后5天或12天以500 PFU/只的vv rMd5进行攻毒。取90天前疑似MD特有病变脏器和90天后所有存活鸡心脏、肝脏、脾脏做病理切片,免疫后5天,GX0101Δmeq-BAC和CVI988/Rispens保护指数分别为33%和87%;免疫12天后,GX0101Δmeq-BAC的保护指数为53%。结果表明,GX0101Δmeq-BAC免疫可以提供一定的免疫保护。5. MDV GX0101Δmeq-H9-HA的构建:以pcDNA3.1为载体,构建了可在CEF中高效表达AIVH9亚型HA基因的真核表达质粒。进而利用“Red/ET重组”技术,以AIV H9亚型HA基因真核表达盒取代了GX0101的meq基因,成功构建了能表达HA基因的重组马立克病毒rGX0101Δmeq-H9-HA。上述系列研究为新型高效的MDV基因工程疫苗和AIV基因工程疫苗研制开辟了新的思路。