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p48.2蛋白是一个具有Ⅰ类细胞因子受体保守功能域的免疫新分子。本实验室从K562细胞中克隆出p48.2,并提交NCBI GenBank(DQ298450)。p48.2基因定位在17q11.2,邻近NF1基因,在神经纤维瘤患者中,p48.2基因常与NF1基因一起缺失。p48.2基因编码区全长1317 bp,编码一个438个氨基酸的蛋白质。在以往的研究中发现,p48.2在细胞中的过表达可以使细胞周期停滞在G0/G1期。我们预测它是一种细胞周期负性调节因子,并进一步探讨了其分子机制。生物信息分析显示:p48.2基因进化高度保守,多种生物体内均有其同源蛋白。它不具有跨膜结构域,也没有核定位信号和细胞器定位信号,是一种胞浆可溶性蛋白质。对p48.2结构域分析显示:p48.2蛋白具有一个Fn3功能域,该功能域内部靠近C-末端,有一个RGD序列和Ⅰ类细胞因子受体特有的WSXWS基序。RGD序列是整合素和其配体相互作用的识别位点,介导细胞与细胞外基质及细胞间的粘附作用,同时具有信号传导功能。本课题的一部分工作是探讨p48.2蛋白中RGD结构域对其生物学活性的影响,具体研究如下:1)利用PCR定点突变技术构建了RGD→RGE和RGD缺失的重组真核表达质粒pCMV-RGE和pCMV-DEL。2)将pCMV-p48.2和两种突变质粒转染293T细胞,免疫荧光染色检测到p48.2及突变体均定位在细胞浆,充分表达后有向胞膜运动的趋势,RGD序列缺失后未影响p48.2蛋白的定位。3)将p48.2基因和两种突变基因亚克隆入pEGFP-N1,利用GFP/DNA双标记流式细胞技术检测细胞周期,p48.2及其突变体均可诱导293T细胞G0/G1期停滞,S期减少。4)将pCMV-p48.2和两种突变质粒转染293T细胞,RT-PCR检测他们均能下调周期蛋白D1、D2的表达。上述结果提示p48.2蛋白是一种胞浆蛋白,它在293T细胞中过量表达可以下调周期蛋白D1、D2的表达,使细胞周期停滞在G0/G1。RGD结构域未参与p48.2蛋白细胞内定位的调节,也没有影响p48.2蛋白抑制细胞周期、下调周期蛋白D1、D2的生物活性,因此RGD结构域不是p48.2蛋白的生物学活性的关键位点,这为进一步研究p48.2蛋白抑制细胞周期的分子机制做一铺垫。本课题的另一部分工作是将p48.2基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,将重组质粒pGEX-p48.2导入大肠杆菌BL21,诱导表达GST融合蛋白,经GST亲合层析纯化蛋白。获得的GST-p48.2融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备了多抗血清,经ELISA、Western blot鉴定,该多抗血清具有较高效价,能与p48.2蛋白发生特异性反应。p48.2多克隆抗体的成功制备为进一步研究p48.2的功能提供了一个有用的工具。