菊花(Chrysanthemum ×morifolium)的花是由舌状花和管状花两种小花着生在肉质花托上构成的头状花序。头状花序的结构非常复杂,由外到内分别为总苞、花托、舌状花、管状花,其中两种小花的分化和发育是栽培菊花千姿百态花型形成的基础。两类小花在相同的遗传背景下,在着生位置、性别、对称性、器官融合、色素成分上均存在显著差异。目前对于高等植物拟南芥(Arabidopsis taliana)和金鱼草(Antirrhinum majus)等模式植物的花发育调控模型已经有了较为明确的认识,但迄今为止,关于高等植物花器官发育的遗传调控模型尚无法解释菊花头状花序花器官的遗传调控模式,以及在相同遗传背景下两类小花分化和发育的调控机制,这也限制了菊花实现花型改良的定向育种。由于菊花遗传背景背景复杂,花型多变,本文作者以菊花近缘种之一的二倍体植物甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)作为研究头状花序结构的模式植物。以甘菊两类小花的分化入手,对头状花序上两类小花的不同发育阶段进行转录组测序分析,分离花器官发育相关基因并对其在甘菊和菊花头状花序上的表达模式进行研究;通过构建甘菊遗传转化体系以进行基因功能分析;运用酵母双杂交的方法对对花器官发育相关蛋白之间的互作模式进行探究。基于此,构建甘菊和菊花花器官发育的遗传调控模型。本研究获得了以下主要结果:(1)利用4个软件(Bestkeeper,NormFinder,GeNorm和Reffinder)对9个候选内参基因稳定性进行评估。结果表明,SAND(SAND family protein)在甘菊花发育过程中各组织间最稳定;大菊品种间SAND和PGK(Phosphoglyceratekinase)稳定性最高;小菊品种间PGK稳定性最高。同时作者还发现,在菊花不同品种内最佳的内参基因也存在差异:PGK基因在4个菊花品系(LFC2、LFC3、SC1、SC2)内部表现最好;F-box(F-box protein)、Actin(Actin related protein 2)、MTP(Metalloprotease)则分别为3个菊花品系(LFC1、LFC4、SC3)中稳定性最高。建议选择某一菊花品种时,有必要对该品种的内参基因进行筛选。此外,作者通过分析DFR(dihydroflavonol 4-reductase)和CYF(lycopene e-cyclase)同源基因的相对表达量验证内参基因的有效性。这一研究为菊花花发育相关基因表达研究提供了稳定的内参基因资源。(2)以两个发育阶段的甘菊舌状花和管状花为实验材料,运用新一代高通量测序技术(NGS)进行转录组分析。共获得47893条unigenes,平均长度达到1772bp。共有4161 1 条unigenes(86.88%)可以被Nt、Nr、KEGG、Swissprot和eggNOG中的一个数据库注释。分别比较不同发育阶段的舌状花和管状花,发现分别有16和411条unigenes在舌状花和管状花中高表达。比较两类小花的发育过程,上调的基因均多于下调的基因,说明更多的基因是随着花发育表达量升高的。(3)对两类小花的比较研究发现,ClCYC2-like基因、B类MADS-box基因ClAP3、ClP1在舌状花中表达量要高于管状花,而C类MADS-box基因ClAG1、ClAG2以及花粉发育相关基因在舌状花中的表达量低于管状花。通过对转录组的分析,作者还发现个别激素合成相关基因在两类小花不同发育阶段之间表现出规律的表达变化:一个赤霉素合成相关基因在两类小花中均可以随着发育而表达明显上调;生长素合成基因有八个unigenes表现出表达差异,其中四个随舌状花开放上调,四个随管状花开放上调;PIN是生长素相应的一类重要转录因子,PIN的表达随着管状花开放而上调;茉莉酸有四个基因在舌状花中随着开放上调,而细胞分裂素和乙烯各有两个基因和三个基因随舌状花开放下调。通过在菊花两类小花中的表达验证发现,菊花和甘菊舌状花与管状花间的基因表达模式相同。同时还发现,在菊花的桂瓣类小花中ClAG1、ClAG2、ClCYC2-like基因的表达水平介于舌状花与管状花之间。(4)从转录组数据中分离到11个甘菊花器官发育相关基因的cDNA全长,包括7个花器官发育的同源异型基因和CYC同源基因。对甘菊和菊花头状花序上7个不同的花器官(总苞、花托、胚珠、舌状花花冠、管状花花冠、雄蕊、雌蕊)的基因表达模式进行了探究。总苞中高表达的基因主要为DenFUL、ClCYC1和ClCYC3;花托中高表达的基因主要为DenFUL、ClAP2、ClSEP1、ClSEP3;舌状花花冠中高表达的基因包括ClAP3、ClPI、ClSEP1、ClSEP3和4个CYC2-like基因;管状花花冠中高表达的基因主要包括 ClAP3、ClPI、ClAG1、ClAG2、ClSEP1、ClSEP3和 DenFUL;ClAP2在雄蕊中明显高表达,其次还有ClCYC2和ClCYC4;雌蕊中高表达的基因主要包括DenFUL、ClAG1、ClAG2、ClSEP3和3个CYC2-like基因;胚珠中高表达的基因包括ClAP2、ClSEP1和3个CYC2-like基因。甘菊和菊花中花器官发育相关基因的表达模式基本一致。部分基因在甘菊和菊花中的表达模式也表现出一定差异,如ClAP2在甘菊胚珠中表达量最高,在小菊SC1中,雄蕊为表达量最高的器官;C类基因在菊花SC1中在胚珠和雌蕊的表达量均较高,而在甘菊胚珠中则较低。据此,作者提出高等植物花器官发育的同源异型基因在菊花头状花序的发育过程中表达分布方式与模式植物不同。(5)运用酵母双杂交的方式对蛋白之间的互作关系进行了分析。结果显示甘菊花器官发育相关多个蛋白之间可以通过相互作用形成二聚体,包括六对互作蛋白:DenFUL和 C1AG2、C1AP2和 C1SEP1、C1AP3 和 C1PI、C1CYC1 和 C1CYC2、DenFUL和C1CYC2、C1AP2和C1CYC1。此外,还有很多蛋白之间证明存在单向互作。由此说明菊花头状花序发育过程调控基因之间存在复杂的互作关系,即同源异型基因内部存在互作、ClCYC2-like基因成员之间存在互作、同源异型基因和ClCYC2-like基因成员之间也存在互作。(6)在已经建立的甘菊下胚轴再生体系的基础上,以甘菊下胚轴为外植体,对影响转化体系的5个因素进行筛选,尝试利用农杆菌介导的方法获得最佳转化体系。甘菊下胚轴在不经过预培养,农杆菌浓度OD600=0.4时浸染10 min,共培养2 d,延迟培养1 d时抗性芽分化率和转化率均最高。通过卡那霉素抗性筛选及PCR检测,获得45株PCR阳性植株,阳性转基因植株频率为5%,并获得6株PCR阳性转ClCYC3基因株系。建立甘菊高效的转化体系可以为后续基因功能验证提供很好的技术基础。根据上述研究结果,作者提出高等植物花器官发育相关同源基因在菊科植物头状花序上的表达发生了重新分布,其中CYC2-like基因、B类和C类MADS-box基因可能参与调控了甘菊和菊花头状花序两类小花的分化,并据此构建了菊花头状花序上花器官发育相关基因的表达模型。