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干扰素调节因子7(Interferon regulator factors7,IRF-7)是调控I型干扰素表达的关键因子,因此在宿主抗病毒反应中起关键的作用。在病毒感染细胞的过程中,IRF-7除了诱导干扰素的产生,其本身也能直接与病毒基因启动子相互作用,对病毒基因的表达加以调节。IRF-7作为干扰素调节因子家族(interferon regulatorfactors,IRFs)的成员,是通过与启动子中的干扰素刺激应答原件(IFN-stimulationresponse elements,ISRE)结合来调控靶基因的转录。其活性很大程度上受其DNA结合能力的影响。
IRF-7蛋白分子中一共有15个赖氨酸,分布在蛋白质DNA结合结构域,组成型激活结构域,信号应答结构域和抑制结构域中。本文对IRF-7中的赖氨酸突变对其结合ISRE能力的影响进行了研究。首先,本文构建了一个原核表达质粒:pET28a-FLAG-IRF7,能诱导表达带His和FLAG双标签的蛋白,其中His标签用于纯化,FLAG标签用于检测。而后,将15个IRF-7的赖氨酸突变体的编码序列亚克隆到这个质粒中。利用构建的16个原核表达质粒,本文纯化了IRF-7的野生型蛋白和15个赖氨酸突变体蛋白用于结合DNA活性的测定。
利用建立的DNA-蛋白质结合检测系统,本文检测野生型及赖氨酸突变体的IRF-7对ISRE的结合能力。ISRE探针序列来源于人类8型疱疹病毒(HumanHerpesvirus8,HHV-8)的开放读框57(ORF57)启动子中的ISRE元件。结果表明赖氨酸残基突变成精氨酸后会对IRF-7的DNA结合能力产生一定的影响。其中45、61、92、120位点赖氨酸突变成精氨酸会使IRF-7完全丧失与ISRE的结合。本文的研究为探讨IRF-7通过结合ISRE对靶基因的调控机制奠定了基础。
在研究赖氨酸突变对IRF-7的DNA结合能力影响的同时,本文利用大肠杆菌SUMO修饰系统研究了IRF-7野生型及各赖氨酸突变体蛋白的SUMO修饰情况。结果表明IRF-7可以被SUMO修饰,但是各赖氨酸突变对IRF-7的修饰状态无明显影响。