近视是最普遍的屈光不正，人群中有着很高的发病率，其患病率各国报道不一。在北美、欧洲和澳大利亚人群中发病率为20-30％，据报道在东南亚地区的发病率高达80％。近视的主要损害在于眼球增大进而引起脉络膜视网膜的病理性改变，如脉络膜视网膜变性，视网膜脱离等。超过90％的高度近视患者有眼球病理的改变。因此在发达国家中，它成为致盲的首要原因之一。近视眼作为一个全球性的医学和社会问题，已引起更多人的关注。目前还没有任何一种方法能够明确地显示可延缓近视的发展。归根结底是因为近视的发病机制不清，难以找到有效的方法来治疗，所以探讨近视的发病机制对近视眼的防治具有重要的意义。 近期的研究表明眼球的大小和形状是由巩膜在生长过程中的功能形成的，巩膜的重塑在近视的发展中是一个内在的特征，巩膜生化的改变是其质变的前提，最终可导致近视的发展。视黄酸在眼球发育过程中发挥着重要的作用，参与了视觉引导的眼球生长。最近的研究发现视黄酸在视网膜、脉络膜上均能合成和分泌，且能影响巩膜的代谢。而视黄酸是通过什么途径最后对巩膜发生作用，由此引起巩膜细胞和基质的变化机制目前尚不清楚。因此，从分子和基因水平探讨视黄酸在人巩膜细胞的作用将为近视眼发病机制的研究提供可靠的理论根据，对近视眼的防治具有重要的意义。 第一部分透镜诱导豚鼠屈光不正的实验研究 目的：观察凹透镜和凸透镜对豚鼠眼球生长和屈光变化的影响，建立透镜诱导型屈光不正动物模型，探讨CRALBP在实验性近视眼巩膜中的作用。 方法：3～4周龄有色豚鼠47只，随机分成7组，右眼分别戴不同度数的凸或凹透镜，其左眼作为对照眼，戴镜前和戴镜后第11天分别测量其眼轴长度、屈光度，观察其变化。用HE染色测量诱导近视眼巩膜和对照眼巩膜的厚度变化。通过免疫组化和蛋白质免疫印迹的方法检测CRALBP在豚鼠诱导近视眼和对照眼的视网膜、脉络膜和巩膜的表达。 结果：戴镜后第11天，与戴镜前相比，戴+4.00D、+8.00D组的豚鼠眼分别增加了+1.46D与+1.58D的相对远视(P＜0.05)；戴-4.00D、-8.00D、-15.00D组的豚鼠分别增加了-2.92D、-3.17D、-3.10D的相对近视(P＜0.01)；而戴0.00D、-2.00D组的豚鼠的屈光度差异无统计学意义(P＞0.05)。所有七组豚鼠的眼轴长度在实验眼和对照眼之间差异无统计学意义(P＞0.05)。分别将对照眼和透镜诱导近视眼后极部巩膜HE染色，结果显示诱导近视眼巩膜比对照眼巩膜变薄。免疫组化结果显示，和对照眼相比，诱导近视眼的CRALBP在脉络膜和巩膜中的表达明显降低，在视网膜中的表达升高。Westernblotting结果和免疫组化结果相对应，CRALBP在诱导近视眼巩膜中的表达明显降低。 结论：豚鼠眼球生长发育受透镜影响，可被用来建立一种简单经济的屈光不正动物模型。和对照眼相比较，诱导近视眼巩膜变薄。CRALBP在眼球发育以及近视眼形成过程中可能参与了RA的转运与调节。 第二部分视黄酸对体外人巩膜成纤维细胞影响的研究 目的：探讨全反式视黄酸(all-transretinoicacidat-RA)对培养的人巩膜成纤维细胞(humanscleralfibroblastsHSF)的形态、增殖以及细胞周期的影响，从而探讨at-RA在近视眼巩膜重塑中的作用。 方法：HSF传代至第四代后以1×105/孔的密度接种于96孔板或以1×106的密度接种于25cm2的培养瓶，以含10％FBS的DMEM/F12培养液培养，当细胞长满瓶子80％～90％时，培养液转换为含浓度为5×10-6M、1×10-5M、2×10-5M，5×10-5Mat-RA的DMEM/F12。以未加RA组作正常对照，于12、24、48、72小时后观察HSF形态；96孔板以浓度1×10-4M，1×10-5M，1×10-6M，1×10-7M，1×10-8Mat-RA作用HSF24、48、72小时后用MTT法测定其增殖情况；以浓度5×10-6M、1×10-5的at-PA作用于HSF，24、48小时后用FCM检测细胞周期情况。 结果：不同at-RA的剂量对HSF的形态、增殖有程度不同的负性影响。At-RA刺激后HSF细胞数目减少，细胞收缩，突起减少，部分裂解，胞浆内有空泡和颗粒形成，细胞之间的间隙增宽，细胞变得细长，呈束状或不规则排列。在高浓度(1×10-4M)时，细胞大部分裂解，看不到完整的细胞存在，只有裂解的碎片。MTT法显示at-RA对巩膜成纤维细胞有明显的抑制作用，该效应呈剂量依赖性反应。FCM结果显示经at-RA刺激HSF24、48小时后，和对照组比较，随着at-RA浓度和时间的增加，G0/G1期细胞的比例逐渐上升，而S期和G2期细胞比例相应下降，细胞被阻滞在G0/G1期。 结论：RA可以抑制体外培养的人巩膜成纤维细胞增殖和DNA合成，RA的浓度变化最终引起巩膜成纤维细胞形态和功能的改变。RA可能是近视发生过程中的信使物质。 第三部分视黄酸对人巩膜成纤维细胞中CRABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1表达的影响 目的：利用基因芯片技术筛选RA培养HSF后相关基因群的表达变化，以探讨RA作用于HSF的相关通路。用不同浓度RA培养HSF后，HSF表达CPABP、CRALBP、MMP-9和TIMP-1的变化，以从分子水平解释RA的作用机制。 方法：HSF传代至第四代后以1×106的密度接种于25cm2的培养瓶，以含10％FBS的DMEM/F12培养液培养24小时后，培养液转换为含浓度为1×10-5MRA的DMEM/F12，以未加RA组作正常对照，继续培养48后用Trizol一步法提取细胞中的总RNA，对样品RNA进行荧光标记，通过杂交与清洗，对标记的人类全基因组寡核苷酸芯片进行扫描，采用图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化，最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。将细胞以103～106传代到25cm2培养瓶，置培养箱中培养24小时后，加入含不同浓度RA的DMEM/F12，以单纯加入DMEM/F12组做对照，培养48小时。或者将细胞用胰酶消化后以104传代到六孔板中，进行细胞爬片培养24小时后，同样加入含浓度为1×10-5MRA的DMEM/F12，以单纯加入DMEM/F12组做对照，培养48小时。采用RT-PCR法检测每组细胞中CPABP-1mRNA和CPABP-2mRNA转录水平；应用免疫细胞化学和荧光免疫细胞化学方法检测CRABP-1、CPALBP、MMP-9、TIMP-1抗体在两组细胞中的表达；用Westernblotting方法检测两组细胞中CRABP-1、CPALBP、MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。 结果：在用2×10-5RA刺激HSF48小时后，人类全基因组寡核苷酸芯片的21571个基因共有562个基因表达有差异。其中运输36、转录调控30、信号60、逆境反应25、代谢133、发育67、细胞组织与生物发生15、细胞运动18、分化3、细胞周期25、细胞粘连31、细胞凋亡15个基因表达有差异。用不同浓度RA培养HSF后，和对照组比较，CPABP-1mRNA水平没有明显变化，而CRABP-2mRNA水平在刺激24小时后有轻微降低，但48小时后则明显降低。免疫细胞化学、荧光免疫细胞化学和Westernblotting显示CRABP-1和CRALBP在RA刺激HSF细胞后，表达轻微降低，MMP-9表达基本无变化而TIMP-1表达轻微降低。 结论：基因芯片对于研究RA对HSF影响的基因筛选快速有效，可同时发现多条基因通路变化。视黄酸结合蛋白在RA抑制HSF活性中发挥了一定的作用；MMPs及TIMPs参与了HSF的ECM的重塑；它们在近视眼的形成与发展中起了重要的作用。