【摘 要】
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目的:动物实验:通过观察PM2.5暴露对去势致骨质疏松症大鼠腰椎（L3-L5）骨密度、股骨骨组织形态及生物力学的影响,探究PM2.5与绝经后骨代谢的关系;细胞实验:利用Transwell小室模型来建立成骨-破骨细胞体外共培养体系,不同浓度的PM2.5染毒后研究PM2.5暴露对共培养体系的细胞毒性、氧化损伤以及Nrf2/ARE经典抗氧化通路的影响,初步探讨PM2.5在骨代谢中的作用机制。最终为PM2
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目的:动物实验:通过观察PM2.5暴露对去势致骨质疏松症大鼠腰椎（L3-L5）骨密度、股骨骨组织形态及生物力学的影响,探究PM2.5与绝经后骨代谢的关系;细胞实验:利用Transwell小室模型来建立成骨-破骨细胞体外共培养体系,不同浓度的PM2.5染毒后研究PM2.5暴露对共培养体系的细胞毒性、氧化损伤以及Nrf2/ARE经典抗氧化通路的影响,初步探讨PM2.5在骨代谢中的作用机制。最终为PM2.5与绝经后女性骨质健康的关系提供实验依据。方法:动物实验1.3周龄雌性SD大鼠（SPF级）适应生长一周后随机分为对照组、手术组和PM2.5染毒组行气道滴注,滴注5月末手术组和PM2.5染毒组行卵巢去势手术,对照组行卵巢旁脂肪组织摘除术。2.去势后大鼠继续气管悬浮滴注至9月末,测定去势后滴注第9月末各组腰椎（L3-L5）骨密度（bone mineral density,BMD）数值。3.在气道滴注的第9月末无菌条件下取出双侧股骨分别用于骨组织形态学（HE染色）及进行骨生物力学相关指标检测。细胞实验4.利用Transwell小室建立成骨-破骨细胞体外的共培养体系;5.不同浓度的PM2.5染毒共培养体系48h后运用CCK-8试剂盒检测共培养体系下成骨细胞的存活率;6.共培养体系经PM2.5染毒48h后采用TBA法测定细胞悬液中氧化应激指标MDA的含量,WST-1法测定SOD的活力,比色法检测GSH-Px水平。7.运用蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测染毒后共培养体系中成骨细胞氧化应激Nrf2信号通路核因子E2相关因子（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）蛋白表达水平。结果:动物实验1.实验结果显示手术组的腰椎骨密度为0.223±0.032,与对照组比较,明显下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）,提示切除大鼠双侧卵巢造模成功;与手术组相比,PM2.5组骨密度差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.骨组织HE染色光镜下观察:对照组可见骨小梁排列紧密,连续性好,骨髓腔较少见脂肪空泡结构;手术组与对照组相比出现骨小梁断裂,骨小梁数目减少,排列疏松紊乱,骨髓腔变大,骨髓腔中出现较多的脂肪空泡结构;PM2.5组可以看出多处出现骨小梁断裂,连续性变差,间距变大,骨小梁数目进一步减少,排列明显紊乱。3.三点弯曲实验结果显示:手术组的弹性载荷、极限载荷、弹性模量明显低于对照组（P＜0.05）,进一步这说明该模型复制是成功的;而PM2.5组与手术组相比,上述力学参数也降低,其中弹性模量差异具有统计学意义（P＜0.05）。细胞实验4.破骨细胞TRAP染色鉴定:可见到部分细胞的胞浆变为酒红色或浅紫色,体积增大、胞浆伸展、空泡化,内含有多个细胞核,这些都是成熟破骨细胞的标志,表明RAW264.7细胞能被成功诱导为破骨细胞。5.与对照组（设其生存率为100%）相比,当PM2.5浓度为25μg/mL时,细胞存活率虽然降低,但与对照组相比无显著性差异;当PM2.5染毒浓度为50、100、200μg/mL时,成骨细胞存活率逐渐下降,与对照组比较有统计学意义（P＜0.05）;各个浓度组之间成骨细胞存活率不存在统计学差异。6.随着PM2.5浓度的递增,MDA含量呈上升趋势,在50、100和200μg/mL剂量组,MDA含量与对照组比较升高,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;SOD活性逐渐降低,抗氧化的能力减弱,50、100、200μg/mL组SOD活性与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;在100和200μg/mLPM2.5浓度组,GSH-Px活性与对照组比较降低,且差异有统计学意义（P＜0.05）。7.Western Blot检测成骨细胞Nrf2信号通路的相关蛋白水平显示,随着PM2.5浓度的增加,Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白水平表达呈浓度依赖性下降;与对照组比较,50μg/mLPM2.5 组 HO-1、NQO1,100、200μg/mLPM2.5组 Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平表达均下降（P＜0.05或P＜0.01）。结论:1.PM2.5加重去势SD大鼠BMD及骨生物力学的下降,使骨组织结构进一步骨质疏松化,对去卵巢大鼠骨质丢失起到加速作用。2.PM2.5染毒会打破共培养体系中成骨细胞氧化应激平衡,MDA生成增加,SOD、GSH-Px活力下降,使成骨细胞存活率降低。3.PM2.5暴露时,Nrf2抗氧化信号通路会被抑制,Nrf2及下游抗氧化的物质HO-1和NQO1蛋白表达下调,减弱机体抗氧化能力进而促进成骨细胞氧化应激的增加,最终影响骨代谢。
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