目的:群体感应（Quorum Sensing,QS）是指细菌通过感知菌群密度变化来调控自身重要基因表达的群体行为。N-（3-氧代十二烷酰基）-L-高丝氨酸内酯（N-（3-oxododecanoyl）-L-homoserine lactone,AHL）是最具代表性的一类群体感应分子,由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.a）分泌。研究指出AHL对宿主细胞具有非常广泛的生物学调节作用。例如,AHL可通过损伤细胞线粒体或激活膜表面死亡受体来诱导细胞凋亡;AHL还有广泛的免疫调节功能诸如破坏上皮细胞连接、诱导免疫细胞趋化、激活核因子-κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）介导的炎症反应。另一方面,口腔内存在多种细菌,通常情况下菌群之间相互平衡维持的共生关系并不致病,但在某些重症牙周炎和持续性根尖周病等以骨缺损为主要症状的口腔疾病中,机会致病菌P.a会被特征性的检出,且有学者提出牙周主要致病菌合并P.a感染显著增加了牙周病的炎症和骨破坏的程度,因此,P.a与骨损伤之间可能存在因果关系。此外,P.a常以生物膜的形式存在,有研究指出,AHL在P.a体外生长的生物膜中大量积累,其浓度可高达300-600μM。因此,鉴于AHL强大的生物调节活性,AHL是否在牙源性骨破坏的相关疾病中发挥了重要的作用,引发了我们的关注。成骨细胞代谢是一个协调良好的生理过程,包括成骨细胞向骨细胞的分化以及成骨细胞的自身凋亡,二者相互平衡,这对于维持骨骼的质和量至关重要。成骨细胞分化通过上调成骨关键基因如Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）和Osterix的表达来提升成骨功能蛋白如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,Bsp）的表达,以此促进骨形成。而成骨细胞凋亡的发生主要是通过激活线粒体介导的内源性凋亡信号,启动细胞程序化死亡过程,清除受伤或多余的成骨细胞,以保证成骨细胞的分化平衡,从而维持了成骨细胞代谢的稳定性。成骨细胞的分化和凋亡相互制约,但又同时受某些上游信号分子例如钙离子(Calcium ion,Ca2+)的调节。Ca2+是成骨细胞功能的重要调节剂,细胞内Ca2+水平的升高连同下游信号通路的激活可以促进成骨细胞分化;但如果细胞内Ca2+超负荷又会诱导活性氧的产生并触发成骨细胞的凋亡。在正常的生理条件下,成骨细胞分化和凋亡受到严格调控,相互协调以维持成骨细胞的代谢平衡。然而作为细胞内的第二信使,Ca2+信号会受到某些细菌分泌物的干扰,进而导致成骨细胞代谢异常。同时,AHL已被证明可以通过调控Ca2+信号,诱导人血小板和肠杯状细胞中活性氧的释放、导致精子顶体的过早丢失、促进气道上皮细胞促炎性细胞因子的产生、或抑制上皮细胞间隙连接的细胞间通讯。因此,AHL是否也可以通过调控细胞内Ca2+来影响成骨细胞的代谢引发了我们的关注。在本研究中,我们检测了AHL对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1凋亡和分化的影响,探讨AHL诱导的胞内Ca2+释放模式对成骨细胞凋亡和分化的共同调控作用,揭示AHL对成骨细胞代谢潜在的影响机制,以期为牙源性骨缺损的治疗提供更多的理论支持。研究方法:1.实验方法1.1、AHL对成骨细胞凋亡的影响1.1.1不同浓度AHL（10、20、30、40、50μM）作用MC3T3-E1细胞1、3、5 d,显微镜拍照观察细胞形态,CCK-8检测细胞活性。1.1.2不同浓度AHL作用MC3T3-E1细胞24 h,TUNEL（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated d UTP Nick-End Labeling）法荧光标记凋亡细胞,荧光显微镜检测凋亡细胞并统计每mm2凋亡细胞数。1.1.3 AHL（50μM）作用MC3T3-E1细胞1、3、6、12、24 h或用不同浓度的AHL作用MC3T3-E1细胞3 h,Western blotting检测Cleaved-Caspase-3和CleavedPARP的蛋白表达。1.1.4红色线粒体荧光染料预染MC3T3-E1细胞线粒体,再加入绿色荧光标记的AHL（30、50μM）作用15 min,使用共聚焦激光扫描显微镜系统观察AHL与线粒体的共定位情况。1.1.5 AHL（30、50μM）作用MC3T3-E1细胞15 min,采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。1.1.6红色线粒体荧光染料预染MC3T3-E1细胞线粒体1 h,加入AHL（30、50μM）作用3 h,再行细胞色素c荧光染色,使用共聚焦激光扫描显微镜系统观察细胞色素c由线粒体到胞质的异位情况。1.1.7 AHL（30、50μM）作用MC3T-E1细胞3 h,分离线粒体及胞浆蛋白,Western blotting检测细胞色素c蛋白在线粒体和胞浆中的表达。1.2、AHL对成骨细胞分化的影响1.2.1含不同浓度AHL（10、20、30、40、50μM）的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞7、10、14及17 d,显微镜拍照观察细胞状态,检测ALP染色。1.2.2含不同浓度AHL的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞3、7、10、14及17d,检测ALP活性。1.2.3含不同浓度AHL的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞21 d,茜素红染色检测矿化结节。1.2.4含不同浓度AHL的成骨分化培养液作用MC3T3-E1细胞7、10、14及17 d,Real-time PCR检测Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达。1.3、AHL调节胞内钙离子释放模式影响成骨细胞凋亡和分化1.3.1绿色荧光标记的AHL（30、50μM）作用MC3T3-E1细胞15 min,再行内质网（Endoplasmic reticulum,ER）膜蛋白Calreticulin的免疫荧光染色,使用共聚焦激光扫描显微镜系统观察AHL与ER共定位情况。1.3.2双荧光Ca2+探针预处理MC3T3-E1细胞,在共聚焦激光扫描显微镜的监测下,加入AHL（30、50μM）,观察胞内Ca2+荧光强度变化,使用Image J进行荧光强度的比例分析,绘制胞内Ca2+水平的变化曲线。1.3.3方法同1.3.2,在共聚焦激光扫描显微镜的监测下,在加入或不加入钙调蛋白拮抗剂W7（10μM）情况下,监测AHL（30、50μM）对MC3T3-E1细胞胞内Ca2+释放模式的影响。1.3.4将W7（10μM）和AHL（30、50μM）同时加入MC3T3-E1细胞作用3 h,Western blotting检测Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP的蛋白表达。1.3.5将W7（10μM）和AHL（30、50μM）同时加入MC3T3-E1细胞分化培养10d,检测ALP染色和ALP活性、Real-time PCR检测Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达。2.统计方法实验至少重复3次,所有数据均以平均值±标准差表示。多组之间的比较采用单因素方差分析和Dunnett t检验进行统计学分析。P<0.05（*）具有统计学差异,P<0.01（**）具有显著性的统计学差异。结果:1、AHL诱导成骨细胞发生线粒体依赖的内源性凋亡与对照相比,AHL（20-50μM）逐渐降低成骨细胞CCK-8的OD值,具有浓度依赖性,但随着时间延长,OD值有所回升;TUNEL法荧光标记凋亡细胞,随着AHL浓度升高,绿色荧光标记的阳性凋亡细胞数逐渐增多;Western检测凋亡标志蛋白,可见Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP的蛋白表达量在3 h到达高峰,并具有浓度依赖性;荧光检测AHL在成骨细胞内定位,可见绿色荧光标记的AHL与红色荧光标记成骨细胞线粒体影像重合;JC-1检测线粒体膜电位,AHL降低了线粒体膜电位,具有浓度依赖性;绿色免疫荧光标记细胞色素c,红色荧光染料标记成骨细胞线粒体,可见AHL组细胞色素c脱离线粒体遍布整个胞质区;分离线粒体和胞浆蛋白,Western检测AHL作用下细胞色素c蛋白的表达,可见细胞色素c蛋白在线粒体中表达降低,在胞浆中表达升高。2、不同浓度AHL对成骨细胞分化有双向调节作用50μM AHL抑制了成骨细胞ALP染色、ALP活性、矿化结节的产生,并下调了成骨分化功能基因Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达;30μM AHL在3 d时抑制了ALP活性,但在7-17 d时,却促进了ALP活性及矿化结节的产生,并上调了Runx2、Osterix、Bsp和OCN的m RNA表达。其余浓度的AHL组,成骨细胞ALP活性及成骨分化功能基因存在一定范围内的正负向波动。3、AHL通过调节胞内钙离子释放模式同时影响成骨细胞凋亡和分化荧光检测AHL在成骨细胞内定位,可见绿色荧光标记的AHL与红色荧光标记成骨细胞ER影像重合;双荧光探针标记成骨细胞胞内Ca2+,可见AHL快速诱导胞内Ca2+水平爆发式升高。钙调蛋白拮抗剂W7完全阻断了AHL诱导的胞内Ca2+瞬间爆发式升高的释放模式,改为持续平缓的上升模式,并最终维持在更高（与只用AHL作用细胞相比）的水平;此外,W7有效抑制了AHL诱导的成骨细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved-PARP的表达,并部分恢复（50μM AHL）或促进（30μM AHL）了AHL作用下成骨细胞的ALP染色或ALP活性。结论:AHL通过调控胞内Ca2+的释放方式,同时影响着成骨细胞凋亡和分化。50μM的AHL会诱导胞内Ca2+的瞬间爆发,导致成骨细胞发生不可逆的线粒体依赖的内源性凋亡反应,大量细胞死亡使成骨细胞代谢平衡被打破,分化功能被严重抑制。30μM的AHL诱导胞内Ca2+爆发程度减弱,引起的凋亡反应相对缓和,Ca2+回落到静息水平后开始匀缓慢的升高则有助于成骨分化信号的激活,加之AHL的促凋亡作用随着细胞培养时间的延长逐渐减弱,细胞活性逐渐恢复,从而出现部分节点的成骨分化增强。本实验采用的所用浓度的AHL在早期均导致成骨细胞不同程度的凋亡,且50μM AHL对成骨细胞分化的抑制作用贯穿实验始终。然而,本实验采用的AHL浓度仍相对较低,相比之下,在P.a被检出的感染中,P.a常常以生物膜的形式存在以逃避宿主免疫,受群体感应影响,生物膜中可产生高浓度的AHL;同时,在重症牙周炎或持续的根尖周感染病灶周围,成骨细胞已经受到了主要致病菌的损伤,处于炎症或免疫状态,这很有可能导致成骨细胞与AHL间的力量失衡,AHL通过干扰Ca2+信号扰乱成骨细胞的代谢平衡,加重骨破坏或使骨再生受阻。因此,对于重症牙周炎或持续型根尖周炎,重新审视机会致病菌以及其群体感应分子对骨的负向调控作用将为疾病的治疗带来帮助。