目的:慢性鼻窦炎（CRS）按表型分为慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）、慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（CRSsNP）。CRSwNP这种类型介导炎症反应的主要特征是2型炎症反应为主,Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-13高表达,伴嗜酸性粒细胞、肥大细胞增多以及IgE含量升高。此外,CRSwNP患者常伴有哮喘、阿司匹林不耐受等疾病。尽管在鼻息肉中关于嗜酸性粒细胞作用的相关研究越来越多,由于活化肥大细胞也可以分泌2型炎症因子,但是在CRSwNP中肥大细胞作用以及该细胞如何被活化仍是一个不太清楚的领域。目前,关于CRSwNP的发病机制的研究现状还不是十分清楚。参与CRSwNP病理生理过程中的微生物群仍被认为是促进炎症反应的机制之一。这些研究提示微生物群可能在慢性鼻窦炎伴鼻息肉的气道上皮先天免疫系统和适应性免疫系统中发挥重要作用。研究发现可以利用病原模式识别受体（PRRs）识别微生物群,toll样受体可被微生物病原体特有的分子（即PAMPs）所识别,并激活免疫细胞应答反应。众多研究学者认为过敏反应的主要效应细胞——肥大细胞,最近对它作为调节细胞方面相关研究表明:在先天免疫、适应性免疫调节中,其通过TLRs发挥重要作用;而且胞内toll样受体介导的主要信号通路之一是髓样分化因子88（MyD88）依赖通路,它能促进核因子（NF）-kB的早期激活,且引起Th2炎性细胞因子释放增加,如IL-4、IL-5和IL-13。因此,TLRs可能通过肥大细胞参与CRSwNP的2型炎症反应。然而,CRSwNP患者肥大细胞中不同亚型TLRs的表达与正常对照组之间的关系,到目前为止还没有相关报道。本研究旨在探讨慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）患者和正常对照组的新鲜钩突黏膜组织中的肥大细胞的胞膜和胞内不同亚型toll样受体（TLRs）的表达差异性;探讨不同亚型的toll样受体表达与CRSwNP的临床症状严重程度的相关性;通过构建分泌2型炎症反应细胞因子IL-5的活化人肥大细胞（HMC-1）,进一步验证不同亚型的toll样受体表达及其介导下游信号通路髓样分化因子88（MyD88）/核因子kappα-B（NF-κB）活化以及对肥大细胞释放2型炎症因子IL-5的影响。研究方法:本研究纳入35例2019年6月-2019年12月在中国医科大学附属第一医院住院诊断明确首次手术患者,入选标准为18-65周岁之间无鼻窦手术史的CRSwNP患者,CRSwNP的诊断依据EPOS2020指南标准。对照组:确诊为上颌窦囊肿的患者。排除单侧鼻息肉、孤立性后鼻孔鼻息肉、变应性真菌性鼻窦炎（AFS）、或其他系统性疾病,包括克罗恩病、原发性免疫缺陷、肥大细胞疾病、血液学疾病、恶性肿瘤、器官移植或既往鼻外科手术。设立分组:CRSwNP组（22例）和对照组:（13例）,收集35例患者的新鲜钩突黏膜组织,临床资料采集内容包括年龄、性别、Lund-Kennedy评分、改良Lund-Mackay CT评分、总VAS评分、外周血嗜酸性粒细胞（%）、外周血嗜碱性粒细胞（%）吸入过敏原检测、是否伴发哮喘、组织嗜酸性粒细胞。1.流式细胞术分离并定量钩突黏膜中TLRs+肥大细胞从22例CRSwNP患者和13例对照组中收集新鲜钩突黏膜组织,将新鲜钩突黏膜组织（35例）在平衡盐溶液中冰上运送。然后,新鲜钩突黏膜标本用PBS洗涤三次,用手术刀剁碎,然后用0.25%胰蛋白酶在37℃下消化50分钟。消化完毕后将单细胞悬液通过70 μm的滤器,将单细胞用预冷的PBS重悬,移入对应标记流式管。为了避免非特异性染色,在加入荧光抗体之前,将每管单细胞悬液中加入FC受体阻断剂在室温下孵育10分钟。然后,参照荧光抗体的说明加入对应抗体,荧光抗体包括肥大细胞表面标记物（CD117,FcεR1α,CD203c）、胞膜toll样受体蛋白（TLR2,TLR4,TLR5）,胞内toll样受体蛋白（TLR3,TLR7）、同型对照抗体。另外,通过Cytofix/Cytoperm Soln试剂盒将肥大细胞的细胞膜固定并破膜后才能检测到细胞内蛋白。流式细胞术检测钩突黏膜组织中肥大细胞胞膜和胞内不同亚型的toll样受体表达的情况。2.比较慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组和对照组的新鲜钩突黏膜组织中的肥大细胞的胞膜和胞内不同亚型toll样受体（TLRs）的表达差异性;不同亚型的toll样受体表达与CRSwNP的临床症状严重程度的相关性。收集临床患者全部数据应用SPSS 26.0进行软件统计学相关分析,计数资料:采用均值±标准差表示;组间比较:独立样本t检验+单因素方差分析表示。计数资料:n（%）表示,组间比较:x2检验分析;Spearman处理变量间的相关性分析,P<0.05,定为差异有统计学意义。3.HMC-1人肥大细胞培养HMC-1肥大细胞接种于75cm2培养瓶中,用完全培养基(RPMI 1640、内含15%胎牛血清、1%青霉素和链霉素于CO2培养箱中培养。（注:培养基三天更换一次,细胞密度80%左右）。4.分泌2型炎症反应细胞因子IL-5的活化人肥大细胞（HMC-1）的构建细胞密度90%以上时,进行传代培养（0.25%胰蛋白酶）。传代细胞接种于96孔板（1×106个/孔,1ml）。取对数生长期的HMC-1肥大细胞,将96孔板中的HMC-1肥大细胞分如下四组（每组设重复样3个）:分别为（1）空白对照组;（2）50ng/ml佛波酯+500ng/ml离子霉素（Absin）组;为抑制TLR2、4、5的表达,使用 Sparstolonin B（TLR2,4 抑制剂,100 μg/mL）和 TH1020（TLR5 抑制剂,0.78 μM）预处理HMC-1细胞,（3）先予100 μg/mL Sparstolonin B预处理24小时后,再加 50ng/ml 佛波酯+500ng/ml 离子霉素（PMA+lonomycin+Sparstolonin B 组）;（4）先予0.78 μM TH1020预处理24小时后,再加50ng/ml佛波酯+500ng/ml离子霉素（PMA+lonomycin+TH1020组）。随着细胞培养6小时后,收集细胞上清液,置于15ml离心管中,离心9min（800rpm/min）,ELISA试剂盒检测细胞中IL-5的表达量。5.细胞因子IL-5的检测收集人的肥大细胞（HMC-1）上清液,参照ELISA试剂盒说明书操作检测细胞因子IL-5的表达情况。6.实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TLR2、TLR4、TLR5的mRNA表达水平使用总RNA提取试剂盒从HMC-1细胞中提取总RNA。然后用PrimeScriptTMRT 试剂盒合成 cDNA。使用 2 X SYBR Green PCR Mastermix 定量TLR2、TLR4、TLR5的mRNA表达水平。采用2-ΔΔCT方法计算归一化为GAPDH的相对表达量。7.Western blotting 检测 TLRs、MyD88 和 NF-κB 蛋白表达水平收集HMC-1的总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白,BCA试剂盒方法测定蛋白质浓度。取20μL蛋白样品,加入缓冲液（5×SDS）,煮沸5 min,使蛋白变性。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,将其上蛋白转移至PVDF膜上,脱脂奶粉5%,封闭1h,孵育一抗（TLR2、TLR4、TLR5、兔抗人MyD88、NF-nBp65 单克隆抗体、phospho-NF-nBp65、GAPDH）,4℃ 过夜,弃去一抗,TBST洗膜3次,每次5 min。二抗（羊抗兔IgG-HRP）孵育2 h,弃去二抗,TBST洗膜,重复3次,1次/5 min。ECL显色,同期以GAPDH作内参。结果:1.临床资料本实验入选35例患者,CRSwNP组:22例;对照组:13例。比较两组研究对象的临床资料结果如下,CRSwNP组临床症状严重程度变量（Lund-Kennedy评分、Lund-Mackay CT评分、总VAS评分、吸入过敏原、伴发哮喘及组织嗜酸性粒细胞）显著高于对照组,P<0.001,差异具有统计学意义;CRSwNP组临床症状严重程度变量（外周血嗜酸性粒细胞（%）和外周血嗜碱性粒细胞（%））高于对照组,P<0.05,差异具有统计学意义。2.CRSwNP组和对照组的总肥大细胞%的比较流式细胞术检测全部标本中总肥大细胞%结果如下,CRSwNP组和对照组患者的钩突黏膜中总肥大细胞百分比（均值±标准差）分别为2.60%±1.55%和1.72%±0.77%,p=0.001,差异有统计学意义。结果显示,CRSwNP组总肥大细胞%高于对照组。3.慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组和对照组的新鲜钩突黏膜组织中的肥大细胞的胞膜toll样受体2、4、5的表达评估CRSwNP组和对照组的新鲜钩突黏膜组织中肥大细胞胞膜toll样受体2、4、5的表达水平。CRSwNP组和对照组中TLR2+、TLR4+、TLR5+的肥大细胞%结果显示如下,分别为 TLR2（94.85%±2.17%,88.24%±5.75%）、TLR4（94.85%±2.15%,83.48%±3.72%）和 TLR5（95.87%±1.50%,85.53%±6.84%）,P<0.001,差异有统计学意义。结果表明,CRSwNP患者中TLR2+、TLR4+、TLR5+的肥大细胞%显著高于对照组。4.慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组和对照组的新鲜钩突黏膜组织中的肥大细胞的胞内toll样受体3、7的表达评估CRSwNP组和对照组的新鲜钩突黏膜组织中肥大细胞胞内toll样受体3、7的表达水平。CRSwNP组和对照组中TLR3+、TLR7+的肥大细胞%结果显示如下,分别为 TLR3（49.09%±8.43%,74.60%±5.34%）和 TLR7（41.94%±8.41%,71.46%±7.33%）,P<0.001,差异有统计学意义。结果表明,CRSwNP患者中TLR3+、TLR7+的肥大细胞%显著低于对照组。5.TLRs与研究对象的临床变量之间的相关性本研究中,依据Spearman相关分析,TLR2+、TLR4+、TLR5+肥大细胞%与临床症状严重程度变量（Lund-Kennedy评分、Lund-Mackay CT评分、总VAS评分、伴发哮喘）呈显著正相关性。相反,TLR3+、TLR7+肥大细胞%与这些变量呈显著负相关性。6.活化HMC-1细胞中TLR2、TLR4、TLR5的表达水平TLRs的表达在活化的人肥大细胞系HMC-1中进一步得到验证。与空白对照组比较,PMA 和 lonomycin 作用后,HMC-1 细胞中 TLR2、TLR4 和 TLR5 mRNA显著上调,P<0.001,差异有统计学意义。同样,在活化的HMC-1细胞中,TLR2、TLR4和TLR5蛋白水平表达显著增强,P<0.001,差异有统计学意义。7.ELISA检测细胞因子IL-5的分泌PMA+lonomycin刺激活化的肥大细胞释放细胞因子IL-5。随着细胞培养6小时后,结果显示,与空白对照组比较,PMA+lonomycin组可诱导肥大细胞释放细胞因子IL-5,p<0.001,差异有统计学意义;与PMA+lonomycin组比较,PMA+lonomycin+Sparstolonin B 组和 PMA+lonomycin+TH1020 组均可抑制肥大细胞释放细胞因子IL-5,p<0.001和p<0.01,差异均有统计学意义。8.蛋白免疫印迹（Western blotting）检测活化HMC-1胞内信号通路MyD88/NF-nB蛋白表达Western blotting检测TLR活化下游信号通路MyD88/NF-nB。随着细胞培养6小时后,结果显示,与空白对照组比较,PMA+lonomycin组胞内MyD88、p-NF-nBp65和NF-nB p65蛋白表达水平升高,p<0.001,差异有统计学意义;然而,sparstolonin B对TLR2、4的抑制和TH1020对TLR5的抑制分别可使上述蛋白水平变化明显受到抑制,p<0.001,差异有统计学意义。结论:慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的肥大细胞中存在不同亚型TLRs表达差异及其与临床症状严重程度指标存在相关性,同时活化肥大细胞中TLR介导下游MyD88/NF-κB通路激活并促进分泌2型炎症反应因子IL-5,这些结果表明TLRs通过激活肥大细胞参与慢性鼻窦炎伴鼻息肉的2型炎症反应,为进一步研究慢性鼻窦炎伴鼻息肉的治疗靶点提供新的方向。