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第一部分前额叶皮层突触前Sigma-1受体对D1受体的协同作用及机制Sigma受体早在1976年就被Martin等人发现,是非阿片、非苯环利定类受体。药理学分析表明sigma受体包括2个亚型：sigma-1和sigma-2受体。其中sigma-1受体已被克隆,与其他受体没有同源性,广泛分布于哺乳动物脑中,与学习和记忆、精神分裂症、心理渴求和觅药行为以及药物介导的行为敏化等过程关系密切。我们课题组进行的另一项研究表明：sigma-1受体促进谷氨酸释放的效应或许是由D1受体介导的。为了进一步研究sigma-1受体是如何协同D1受体及其相互作用的环节,本文拟用突触小体(synaptosomes)作为研究突触末梢突触前部分的模型,同时采用生物化学方法结合药理学手段观察sigma-1受体和D1受体相互作用及其作用机制。结果表明：(1)前额叶皮层突触前sigma-1受体激动剂PRE084,SKF10047能够放大D1受体激动剂SKF38393激活的PKA活性增强,sigma-1受体拮抗剂BMY14802能阻断其放大作用。同时,Western blot结果显示前额叶皮层突触前表达Sigma-1受体蛋白。(2)Sigma-1受体激动剂能够放大膜可通透性cAMP类似物CPT-cAMP诱导的PKA活性增强、也能够放大腺苷酸环化酶激动剂forskolin诱导的PKA活性增强,而对D1受体诱导的AC活性增强没有作用,由此推测sigma-1受体激动剂通过D1受体下游的cAMP放大D1受体激活的PKA活性增强,从而参与调节前额叶皮层突触前谷氨酸释放。(3)PKC广谱抑制剂chelerythrine能够阻断sigma-1受体激动剂的放大作用,同时PKC激动剂PDBu能够模拟sigma-1受体激动剂的放大作用。接下来又使用cPKC抑制剂rottlerin和cPKCβ抑制剂CGP53353(4μM),结果证实sigma-1受体活化后下游的PKC,特别是cPKCβⅠ,在放大D1受体信号的过程中起重要作用。同时,Western blot结果也证实了激活前额叶皮层突触前sigma-1受体会引起cPKCβⅠ膜转位。(4)实验中还验证了Ca2+是否参与sigma-1受体的协同作用。结果显示无Ca2+匀浆液及Ca2+螯合剂EGTA、电压依赖性Ca2+通道阻断剂cadmium, L-型Ca2+通道阻断剂nimodipin都能够阻断sigma-1受体的协同作用。以上结果提示,激活前额叶皮层突触前sigma-1受体,通过活化下游PKC,特别是cPKCβⅠ,以及L-型Ca2+通道从而增加突触小体内Ca2+浓度,以此放大D1受体下游信号。这一研究不仅对揭示sigma-1受体和D1受体相互作用的作用机制具有重要意义,同时也对揭不sigma-1受体在脑内的功能及其作用机制提供了有力的证据,对临床药物的设计提供了有效的参考价值。第二部分前额叶皮层突触前磷脂酰肌醇(PI)偶联的D1受体对经典型D1受体信号通路的调节及作用机制多巴胺(dopamine, DA)是最重要的神经递质之一。分子生物学的研究证明DA受体有D1、D2、D3、D4和D55种亚型,均属于G蛋白偶联受体。除了由Gas介导的D1受体的PKA途径(经典D1受体途径,D1 receptor/cAMP/PKA pathway),D1受体还可以调节PLC/IP3信号通路的活性。与经典型D1受体(D1receptor/cAMP/PKA)不同,这型受体被称为磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)偶联的D1受体。文献报道,磷脂酰肌醇偶联的D1受体激动剂SKF83959激活磷脂酰肌醇偶联的D1受体的同时对经典D1受体途径激活的cAMP/PKA活性有抑制作用,但PI偶联的D1受体激动剂SKF83959是否作用于经典D1受体途径及其相互作用的环节尚无报道,是直接作用还是间接作用都需要进一步探讨。为探讨这一问题,本文拟用突触小体(synaptosomes)作为研究突触末梢突触前部分的模型,同时采用生物化学方法结合药理学手段观察PI偶联的D1受体途径(PI-linked D1-like receptors pathway)和经典D1受体途径相互作用及作用机制。结果显示,(1)SKF83959单独对PKA活性没有影响,但是可以减弱经典型D1受体激动剂诱导的PKA活性增强,并且这种调节作用能被SKF83959下游的PLCβ阻断剂U-73122阻断。(2)广谱PKC抑制剂chelerythrine、cPKC特异性抑制剂rottlerin以及cPKCα,β特异性抑制剂Go6976能够阻断PI偶联的D1受体途径对经典D1受体途径的调节作用,而PKCβⅠ,Ⅱ特异性阻断剂CGP53353不能阻断其调节作用,由此初步推测PI偶联的D1受体通过激活下游的cPKCα来调节经典D1受体途径,Western blot结果显示SKF83959能够使cPKCα膜转位,激活cPKCα。(3)无Ca2+匀浆液、Ca2+螯合剂EGTA和Cdk5抑制剂butyrolactone能够阻断PI偶联的D1受体对经典型D1受体的调节作用,并且Western blot结果显示SKF83959能够使突触小体中DARPP-32蛋白Thr75位点磷酸化,而不影响Thr34位点磷酸化水平及DARPP-32蛋白表达。由此可以初步得出以下结论：SKF83959激活PI偶联的D1受体并且通过其下游的cPKCα,Ca2+以及PP2B-Cdk5介导DARPP-32 Thr75位点磷酸化从而下调经典型D1受体激活的PKA活性增强。这一研究不仅对揭示PI偶联的D1受体途径(PI-linked D1-like receptors pathway)和经典D1受体途径(D1 receptor/cAMP/PKA pathway)相互作用的作用机制具有重要意义,同时也对揭示DA受体在脑内的功能及其作用机制提供了有力的证据,对临床药物的设计提供了有效的参考价值。