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背景与目的:全球范围内,肺恶性肿瘤的发病率位于第二位,死亡率则高居第一位,其中非小细胞肺癌约占肺恶性肿瘤总数的85%,非小细胞肺癌主要包括腺癌、鳞癌及大细胞癌,其中肺腺癌约占40%。由于早期诊断方法的缺失,约60%非小细胞肺癌患者确诊时已属中晚期,出现多发性转移,无根治性手术切除机会,以化疗、靶向治疗、免疫治疗、局部放疗及基于全身治疗基础上的姑息性手术治疗为主,而含铂类双药化疗方案治疗有效率仅约30%-40%。近年来迅速发展的分子靶向治疗及免疫治疗,使得肺癌患者的带病生存期得到一定程度的提升,但肺癌患者仍面临着高复发率及转移率的风险。因此,寻找能成为肺癌治疗靶点的新驱动基因,更全面了解肺癌发生发展和转移的分子机制,依旧是肺癌研究的重点。DONSON是一个新近发现的基因,它的主要功能是作为复制叉的一部分,保护和稳定已形成的复制叉,进一步促进、激活细胞周期检查点,从而确保正确的DNA修复过程,避免发生基因突变及染色体断裂。DONSON基因的突变及功能缺失主要与某些先天性发育异常疾病有关,如小头原始侏儒症。近年来有研究发现DONSON在肾透明细胞癌及前列腺恶性肿瘤的发生发展中可能存在重要作用,与肿瘤病理分级、肿瘤分期、淋巴结转移及临床预后密切相关,但相关的分子机制尚待进一步研究。本课题组前期发现DONSON基因在肺癌组织中异常高表达,但关于DONSON在肺恶性肿瘤中的功能和作用机制尚无相关报道。本研究中我们以肺腺癌为研究对象,以DONSON及其下游靶基因为研究重点,从基因芯片、生物信息学、分子生物学、细胞功能学以及实验动物学等多方面开展深入研究,探索DONSON在肺恶性肿瘤发生发展过程中的作用及具体机制,将有助于阐明肺恶性肿瘤的发病机理,为发现新的治疗靶点提供理论依据。方法:1.肺腺癌组织分析及TCGA数据库分析（1）基因芯片检测肺腺癌组织及癌旁组织的差异基因表达;（2）TCGA数据库检索并分析肺腺癌的基因表达谱变化,分析DONSON在肺腺癌及正常组织的表达差异,Kaplan-Meier生存曲线分析DONSON表达与肺腺癌患者生存期预后的关系;（3）qRT-PCR检测DONSON基因在肺腺癌组织及癌旁组织的表达差异;（4）组织芯片检测DONSON蛋白在肺腺癌组织及癌旁组织的表达差异,分析DONSON蛋白表达与肺腺癌患者肿瘤病理特征及生存期预后的关系。2.DONSON对肺癌细胞生物学行为的影响（1）构建DONSON干扰表达慢病毒并转染肺癌细胞系;（2）通过细胞增殖实验、细胞凋亡及细胞周期检测、细胞划痕实验及Transwell实验等检测干扰DONSON表达对肺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力的影响;（3）通过体内裸鼠移植瘤模型验证DONSON对肺癌细胞增殖的影响。3.DONSON-CCNE2对肺癌细胞生物学行为影响的分子机制探索（1）基因芯片检测干扰DONSON表达肺癌细胞基因表达谱的变化;（2）组织芯片检测CCNE2蛋白在肺腺癌组织及癌旁组织的表达差异,分析CCNE2蛋白表达与肺腺癌患者临床病理特征及生存期预后的关系。（3）构建CCNE2干扰表达、DONSON过表达慢病毒,并分别以CCNE2干扰表达、DONSON过表达、DONSON过表达同时CCNE2干扰表达的慢病毒转染肺癌细胞系;（4）通过细胞增殖及克隆形成实验、细胞凋亡检测、细胞划痕实验及Transwell实验等分别检测干扰CCNE2表达、DONSON过表达、DONSON过表达同时干扰CCNE2表达对肺癌细胞增殖及克隆形成能力、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:1.DONSON在肺腺癌组织中显著高表达且影响患者临床预后（1）基因芯片检测发现,在肺腺癌及配对癌旁组织中具有差异表达的基因共2551条,其中上调基因925条,下调基因1626条,DONSON在肺腺癌组织中表达较癌旁组织中明显增加;（2）TCGA数据分析显示DONSON在肺腺癌组织中表达水平明显高于正常组织,DONSON基因表达与患者的生存期密切相关,DONSON表达量越高的患者生存期越短;（3）qRT-PCR结果显示DONSON基因在肺腺癌组织标本中显著高表达;（4）组织芯片结果显示DONSON蛋白在肺腺癌组织中显著高表达,且与肺腺癌患者病理分级、临床预后呈负相关。2.DONSON促进肺癌细胞恶性增殖、迁移及侵袭,抑制肺癌细胞凋亡（1）细胞增殖实验表明干扰DONSON表达显著抑制肺癌细胞增殖能力;（2）流式细胞术检测结果发现干扰DONSON表达后细胞凋亡率显著增加,细胞周期不能顺利从G0/G1期向S期转变,细胞阻滞于G2/M期;（3）细胞划痕实验及Transwell实验结果发现,干扰DONSON表达后细胞迁移及侵袭能力显著下降;（4）成功建立肺癌细胞裸鼠移植瘤模型,结果显示,干扰肺癌细胞DONSON基因表达后,裸鼠移植瘤成瘤率明显下降,瘤体体积显著缩小。3.DONSON通过CCNE2影响肺癌细胞生物学行为（1）基因芯片检测及分析发现,干扰DONSON表达的肺癌细胞中CCNE2表达明显下调;（2）组织芯片检测发现,CCNE2在肺腺癌患者中显著高表达,与肿瘤病理分期、淋巴结转移及临床预后显著相关;（3）干扰CCNE2表达显著抑制肺癌细胞增殖及克隆形成,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移及侵袭;（4）DONSON过表达可进一步显著提升肺癌细胞增殖及克隆形成能力,明显抑制细胞凋亡、促进细胞迁移及侵袭;在DONSON过表达的基础上干扰CCNE2表达可显著下调DONSON过表达对肺癌细胞的生物学行为影响。结论:1.DONSON与CCNE2在肺腺癌组织中异常高表达,二者呈现正相关,并且与肺腺癌患者临床病理特征及总体生存期呈负相关;2.CCNE2是DONSON的潜在下游靶基因;3.DONSON通过调控CCNE2的表达促进肺癌细胞增殖与肿瘤生长。