吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是一组急性或亚急性发病,病理改变为周围神经炎性脱髓鞘或轴索变性,临床表现为四肢对称性迟缓性瘫痪的自身免疫性疾病。其病因与发病机制尚不明确。近年随着神经病理和神经电生理学的进展,将GBS划分为急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)、急性运动轴索性神经病(AMAN)、急性运动感觉轴索性神经病(AMSAN)、Miller-Fisher综合征(MFS)等几种亚型。AMAN临床表现较AIDP重,可累及呼吸肌,其主要病理表现为神经轴索变性,神经电生理主要表现为运动波幅降低。蛋白质组学(proteomics)技术是生命科学进入后基因组时代的标志之一。蛋白质组学可以比较两个或更多的样品之间蛋白质水平,是揭示疾病分子机制,发现疾病标志蛋白,寻找新的药物靶标的理想工具。目前仅有少数GBS患者脑脊液的蛋白质组学研究,尚没有专门针对AMAN细胞模型的蛋白质组学研究。本研究应用蛋白质组技术比较AMAN患者与正常对照组血清对培养的大鼠脊髓运动神经元的影响,旨在发现AMAN相关蛋白质,以深入理解急性运动轴索型神经病分子机制,并为寻找早期诊断治疗急性运动轴索型神经病的有效方法提供实验依据。方法:1.血清的获得:选取符合美国国立卫生研究院拟订的GBS诊断标准的GBS急性期患者,依据Cornblath标准明确划分为AMAN,抽取静脉血离心后获得血清;健康人血清由河北省血液中心惠赠。所得血清均-80°C保存。2.细胞培养:取S-D大鼠胚胎脊髓腹侧半进行原代体外运动神经元的分离培养,在培养第6天,神经元生长旺盛期,给予20%AMAN患者血清进行干预,对照组为正常健康人血清,2小时后收集细胞。3.蛋白提取:应用裂解液(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors),超声震荡法提取神经元蛋白。4.双向凝胶电泳:神经元蛋白质以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳。得到的双向电泳凝胶固定后以镀银或考马斯亮兰R250染色。5.凝胶图像分析:图象分析软件Imagemaster 2D分析电泳图谱。比较蛋白质斑点差异,以正常血清干预的双向电泳凝胶为参考胶,AMAN患者血清干预的凝胶与之比较,根据斑点的位置、大小、形状等参数,软件自动将不同图谱中的相同蛋白质点匹配,不能匹配的蛋白质点及表达量上调或下调超过50%的蛋白质点视为差异点。6.胶内蛋白质酶解:将蛋白质点从考马斯亮兰染色的凝胶上切下后,加入100μl 25mM NH4HCO3/50%乙腈,振荡除去考马斯亮兰染料,凝胶颗粒用冻干机冻干,应用胰蛋白酶进行酶切。7.质谱鉴定:MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定经AMAN患者的血清影响下,培养的脊髓运动神经元发生变化的蛋白质。结果:20%正常人血清干预2小时后,神经元胞体及突起未见明显改变;20% AMAN患者血清干预2小时后,可见部分神经元胞体光晕减退,突起变细、回缩。对于每个蛋白质样品,银染双向电泳凝胶在图像分析软件的帮助下能分辨出1500个以上的蛋白质点,考马斯亮兰染色则能分辨出600个以上的蛋白质点。20% AMAN患者血清干预2h的脊髓运动神经元与20%正常对照组血清干预2h的脊髓运动神经元相比较,有21种差异表达蛋白,分别经MALDI-TOF/TOF串联质谱仪鉴定为不均一核糖核蛋白H、微管蛋白alpha-1A、肌动蛋白、Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase、蛋白酶体α亚基1、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1、14-3-3蛋白、肽基脯氨酸顺反异构酶A、Prohibitin、内质网蛋白29、Peroxiredoxin-6、60 kDa heat shock protein、F-actin-capping proteins,共13个蛋白的表达量降低,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、Ras-related protein Rab-7a、Triosephosphate isomerase、激活蛋白激酶受体、3-磷酸甘油醛脱氢酶、电压门控阴离子选择性通道、Stress-70 protein、Heat shock cognate 71 kDa protein,共8个蛋白的表达量升高,为疾病血清中致病因子作用靶蛋白。结论:在AMAN患者血清作用下,培养大鼠脊髓运动神经元的氧化应激蛋白、突触可塑性相关蛋白、细胞骨架蛋白、细胞凋亡相关蛋白及一些重要代谢酶表达发生变化。此研究对探索AMAN发病的分子机制具有重要意义,所获差异表达蛋白有可能成为AMAN疾病标记蛋白质,也可能成为新的药物作用靶点。