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氟广泛分布于自然界,是一种人体必需的微量元素,但长期过量摄入,可在体内蓄积,引起地方性氟中毒,严重损害机体的骨相和非骨相器官。其损伤可能与氟引发的氧化应激有关,但具体机制仍不明了。细胞凋亡或许是其中的关键一环。近年来,内质网应激所引起的细胞凋亡,已经成为人们研究氟致机体损伤的热点。然而其侧重点多是关于内质网应激在氟致骨相器官损伤方面的研究,而在非骨相器官上研究较少,并且传统的氧化应激检测指标如SOD、MDA等,由于其测定方法受多种因素影响,不仅特异性与敏感性均较低,且所得结果也互有差异或相互矛盾。本研究采用直接测定神经细胞内ROS浓度变化的方法,对进一步探讨氟致神经细胞损伤作用的分子机理有十分重要的意义。PC12细胞来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤,可在神经生长因子(nerve growth factor, NGF)诱导下增殖和分化为有交感神经元特性的细胞,广泛用于神经系统疾病的体外研究。本实验用不同浓度的氟(0.5、1.0、1.5和2.0mM)处理PC12细胞,在不同的时间段(2、4、6、8、12、24和48h)用cck-8染色检测细胞活性；氟暴露2h后,用DCF标记检测细胞内活性氧的水平；氟暴露8h后,用Rhodamine123和JC-1染色检测细胞内线粒体膜电位的变化,用Hoechst-33342检测细胞凋亡状况；氟暴露24h后,用倒置显微镜观察细胞形态变化,应用western blot方法检测凋亡相关蛋白PARP、p-elF和内质网应激相关蛋白XBP-1表达情况。实验结果如下：1.细胞活性检测结果：与对照组相比,染氟2h后,2.0mM组细胞存活率显著下降(P<0.05);染氟4h后,1.5和2.0mM组细胞存活率显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);氟暴露8h及48h后,各组细胞存活率极显著降低(P<0.01);染氟12h后1.0和1.5mM组细胞存活率显著下降(P<0.05),2.0mM组细胞存活率极显著降低(P<0.01);氟暴露24h后,0.5和1.0mM组细胞存活率显著降低(P<0.05),1.5和2.0mM组,细胞存活率极显著降低(P<0.01)。2.细胞形态观察结果：正常细胞呈长梭形,有2到多个突起,染氟24h后,随着染氟浓度的增加,细胞密度逐渐降低,部分细胞开始变圆,凋亡/死亡细胞数量增多,甚至可以看到明显的凋亡小泡和细胞碎片。3.细胞内活性氧水平检测结果：细胞暴露于NaF2h后,随着染氟浓度增加,细胞内活性氧浓度逐渐升高.与对照组相比,1.5mM组和2.0mmM活性氧浓度均极显著升高(P<0.01)。4.线粒体膜电位变化结果：细胞暴露于NaF8h后,随着染氟浓度增加,Rho-123标记的细胞荧光强度基本呈增强趋势,显示细胞线粒体膜电位逐渐降低,与对照组相比,2.0mM组细胞线粒体膜电位极显著降低(P<0.01);JC-1标记的细胞其荧光逐渐由红转绿,说明线粒体膜去极化逐渐加剧,即线粒体膜电位不断降低,表明细胞凋亡发生。5.细胞凋亡检测结果：正常细胞核为长圆形或卵圆形,细胞发生凋亡后,细胞核变圆,核固缩,染色加深,荧光强度增加。与对照组相比,各组荧光强度变化无显著差异(P>0.05),除0.5mM组外,略有升高趋势,表明发生凋亡的细胞数量也略有增多。6.Western blot分析结果：与对照组相比,1.0mmM组XBP-1和PARP蛋白表达水平均显著上升(P<0.05),而PARP剪切带即PARP’蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),其余各浓度、各蛋白表达水平略有浮动,但无显著差异(P＞0.05)。表明PARP可能是细胞凋亡的关键蛋白,XBP-1则可能是内质网应激介导细胞凋亡过程中的关键蛋白之一。结论：氟暴露可导致细胞活性降低,与染氟时间呈负相关性,与染氟剂量也基本上成负相关性；在一定的氟暴露时间段内,细胞内活性氧水平、细胞线粒体膜的损伤程度和细胞的凋亡水平基本与氟暴露水平成线性关系,提示氟暴露致细胞内氧化应激是氟诱导细胞发生凋亡的原因之一,XBP-1则可能是氟致内质网应激介导细胞凋亡过程中的关键蛋白之一,这些研究结果再次为氟致自由基损伤学说提供了佐证。