眼是研究黑色素体发生、黑色素合成以及沉积的优秀模型,因为在眼中存在两种不同胚胎来源的黑色素细胞。具体来说,虹膜基质、睫状体基质以及脉络膜来自于神经脊,而虹膜色素上皮、睫状体色素上皮以及视网膜色素上皮(RPE)来自于视神经色素上皮层。Hermansky-Pudlak综合症(简称HPS)是一种常染色体隐性遗传病,临床症状主要包括眼皮肤白化、视力下降、出血倾向、肺纤维化以及结肠炎等,上述临床症状是由溶酶体、黑色素体以及血小板致密体等溶酶体相关细胞器(LROs)缺陷导致的,该疾病在人类和小鼠中均有发现。其中,pale ear(ep)和pearl(pe)小鼠是人类HPS综合症Ⅰ型和Ⅱ型的小鼠模型。为了研究HPS1和HPS2基因在不同胚胎来源黑色素细胞中的功能,本人对ep和pe小鼠的眼部着色进行了系统研究。首先,不论在发育早期还是成年小鼠中,pale ear和pearl小鼠的眼球着色与野生型小鼠相比都存在明显的下降,而pearl小鼠的着色不足相较pale ear小鼠而言更为严重。在7日龄前,pale ear和pearl小鼠眼球的着色情况较为类似,而在7日龄后,pearl小鼠的眼球着色明显低于pale ear小鼠。与之相符的是,眼球酪氨酸酶含量分析显示pale ear小鼠眼球中的酪氨酸酶在出生第七天后有明显的上升,而pearl小鼠的眼球酪氨酸酶含量在出生第七天后的增加相对缓慢。进一步研究发现,HPS1基因突变在pale ear小鼠眼球两种不同胚胎来源的黑色素细胞中引起了两种不同表型:巨大黑色素体只出现在成年paleear小鼠眼球中的脉络膜、虹膜基质等胚胎神经脊来源的黑色素细胞中,在7日龄的ep小鼠的虹膜基质层尚未有巨大黑色素体出现。而无论在7日龄还是3月龄ep小鼠的视网膜色素上皮层(RPE)以及虹膜色素上皮层(IPE)(来自神经色素上皮层)中都没有发现巨大黑色素体。而睫状体色素上皮层(CPE层)、RPE层以及IPE层等视杯神经上皮来源组织的色素合成不足较神经脊来源的眼中组织更加严重。pearl小鼠的眼球着色弱于paleear小鼠,特别是在脉络膜、虹膜基质、睫状体基质等胚胎神经脊来源的组织中。尽管pearl小鼠的眼球着色较弱,但是我们发现其眼球中的酪氨酸酶含量却高于pale ear小鼠,暗示pearl小鼠眼球中异常转运酪氨酸酶的降解率要低于pale ear小鼠。再者,我们发现pale ear和pearl基因双杂合小鼠的眼球着色与野生型小鼠较为接近,而双突变小鼠的眼球着色比任一单突变小鼠的眼球着色都要更低。此外,pearl小鼠的神经脊来源的眼组织中不存在巨大黑色素体。在7日龄的ep和pe小鼠中,未成熟黑色素体的数目很少,而在成年期的两种小鼠中,未成熟黑色素体开始大量出现。在7日龄ep小鼠的虹膜基质层中不存在巨大黑色素体,而成年小鼠的虹膜基质层中出现了大量巨大黑色素体。因此,我们认为HPS1和HPS2的突变对黑色素体合成的影响随着年龄的增长逐渐显现。Western-Blot结果显示,pe小鼠眼球中Cathepsin-D蛋白的表达量最高,其次是ep小鼠,而野生型小鼠中Cathepsin-D蛋白的表达量最低。pe小鼠虹膜中未成熟黑色素体经由高水平的Cathepsin-D蛋白降解后,黑色素体的数目随之减少,这与我们的电镜观察结果是相互呼应的。黑色素体是眼睛中最重要的色素颗粒,可通过吸收多余的可见光及紫外辐射起到保护眼组织的作用。此外,黑色素体还能作为抗氧化剂、自由基清道夫以及化学毒剂中和剂来保护眼部组织。脂褐质体是眼部另一种有色颗粒,由视网膜的外节膜盘崩解积累而成,会导致眼部光氧化压力的提高。脂褐质随着年龄增加不断积累,其积累趋势与黑色素恰恰相反。我们发现,pale ear小鼠RPE层中的脂褐质积累量明显高于野生型小鼠,并且pale ear小鼠的脂褐质自发荧光的发射波长相较野生型小鼠而言具有明显蓝移,暗示pale ear小鼠的脂褐质存在进一步的光氧化。但是,pearl小鼠RPE中的脂褐质含量以及自发荧光波长都和野生型小鼠没有明显区别。本研究首次对HPS小鼠整个眼球的色素沉着进行了系统分析,发现了不同胚胎来源组织中的黑色素合成方式的不同。本研究还显示HPS1和HPS2基因在黑色素合成和酪氨酸酶转运的过程中发挥着不同的作用。对HPS综合症相关蛋白在黑色素体和黑色素合成相关蛋白转运的研究有助于我们深化对细胞器生成和膜泡运输等基本生命活动的理解和认识。通过这些研究,我们将会发现HPS综合症的治疗手段,甚至通过对HPS综合症的研究得到治疗其它眼皮肤白化疾病的新思路。HPS综合症是白化病中危害最大的一种,为常染色体隐性遗传,可导致出血时间延长、眼皮肤白化、肺纤维化等病状,目前尚无有效治疗方法。近年来的研究表明,HPS是一种单基因病,但其不同亚型涉及多个不同基因的突变。基因突变后,蛋白转运途径受阻,表现为黑色素体、溶酶体、血小板致密体等溶酶体相关细胞器的生物合成或功能的改变。HPS1基因和Ap3b1基因分别是HPS1型和HPS2型的致病基因,当这两个基因发生缺陷后,溶酶体-内体转运途径中的关键蛋白AP-3和BLOC-3将会发生功能上的障碍。由于精子顶体是一种特化的溶酶体,而且精子的成熟过程中需要溶酶体酶降解掉多余的细胞质,所以溶酶体-内体转运系统的障碍可能会引起生殖系统发育及精子发生的异常。然而目前尚未有pale ear和pearl小鼠存在生殖力下降、精子发生障碍以及顶体功能缺陷的报道。在本部分论文中,我们依次在整体、器官、以及细胞分子水平对pale ear和pearl小鼠的生殖系统发育和精子生成进行了全面检查。通过大规模交配实验,我们发现:和对照组相比,与ep雄鼠交配的B6雌鼠的产仔数与受孕几率存在明显降低;而与pe雄鼠交配的B6雌鼠的受孕几率明显降低,但是其产仔数没有明显变化。进一步器官水平的分析表明:ep雄鼠的睾丸、附睾与B6雄鼠相比没有明显形态差异。然而pe雄鼠却存在睾丸发育迟缓及附睾发育不良。激素含量测试表明:pe雄鼠睾酮分泌也显著低于ep雄鼠和野生型雄鼠。在组织水平上,我们发现6周龄pe小鼠的精子发生存在明显障碍。随着小鼠的逐渐发育,成年pe小鼠的精子功能趋于改善,但是精子计数显示:pe小鼠附睾尾精子数<ep小鼠<B6小鼠。在完成对精子数目的分析后,我们利用CASA技术对3种小鼠的精子活力进行了分析,我们发现,野生型小鼠精子活力>pe小鼠>ep小鼠。后续电镜分析显示,ep小鼠精子尾部中段的线粒体排布存在异常。而且CTC染色实验的结果说明ep小鼠的顶体酶释放也存在轻微异常。睾丸支持细胞的细胞质中β-catenin的大量积累将导致Wnt/catenin信号的持续作用,进而导致睾丸发育不良及精子发生受阻。而细胞质中的β-catenin经过PCP-2去蛋白磷酸化作用后将转移到细胞膜上。研究表明,AP-3能识别并结合PCP-2,从而参与PCP-2细胞内转运、定位等过程。我们对B6和pe小鼠睾丸中的β-catenin进行了 Western Blot分析,结果显示:pearl小鼠睾丸胞浆总蛋白的β-catenin表达量高于野生型小鼠。我们推测:当AP-3衔接蛋白复合体出现缺陷时,PCP-2将可能无法正常转运,导致β-catenin的去磷酸化作用异常,进而引起支持细胞胞浆中β-catenin的大量积累。通过对精子发生过程的电镜观察,我们发现pe小鼠的帽期顶体存在异常。在野生型小鼠中,顶体泡区的电子密度比其临近的细胞核电子密度要低,而在pearl小鼠中,顶体泡区的电子密度却要高于其临近的细胞核的电子密度。这暗示某些顶体蛋白的转运可能存在异常。由于金属元素的转运载体可能需要通过HPS蛋白进行转运,而金属微量元素对哺乳动物生殖力的维持具有重要意义。通过全血金属元素含量分析,我们发现pe小鼠中镁元素的含量显著低于野生型小鼠。Zinquin锌离子探针杂交表明,ep和pe小鼠精子头部的锌离子分布于野生型存在一定差异。这说明HPS1和AP3B1基因可能通过调控金属离子转运来影响生殖器官发育和精子发生。本研究在整体水平、器官组织水平以及分子细胞水平上对ep和pe雄鼠生殖力降低的原因进行了分析。虽然ep和pe雄性小鼠都具有生育后代的能力,但是HPS1和AP3B1基因的突变通过多个途径直接或间接影响到了生殖器官发育和精子发生。对相关途径的深入探究将加深我们对蛋白转运及细胞器生成的认识,同时可以为临床不孕不育研究提供新的思路。