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目的:通过检测急性肝衰竭小鼠肝脏巨噬细胞microRNA-138及炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β的表达情况,以探讨microRNA-138对小鼠急性肝衰竭过程中炎症因子表达的影响作用,并利用RNA干扰技术进一步探究microRNA-138、茵陈四苓颗粒联合microRNA-138在肝衰竭小鼠肝脏巨噬细胞炎症因子表达中的作用,为寻找急性肝衰竭新的治疗靶点提供理论依据。方法:(1)用ConA 20mg/kg处理C57BL/6小鼠建立小鼠肝衰竭模型,并分别在静脉注射后0h、1h、3h、6h、12h、24h采集眼底静脉血和小鼠肝脏组织。静脉血用于分离血清进行血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的生化检测。一部分肝组织冻存后用于RT-qPCR检测microRNA-138、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平,一部分肝组织经福尔马林液固定后进行病理学检测。(2)分离正常小鼠的肝脏巨噬细胞后,转染microRNA-138抑制物和模拟物及对应的阴性对照,在含茵陈四苓颗粒含药血清培养基中培养,再用Con A刺激后用RT-PCR方法分别检测microRNA-138及炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表达水平,从而进一步探讨茵陈四苓颗粒与microRNA-138对炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达的影响作用。(3)用ELISA试剂盒检测细胞培养液上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的表达水平,比较空白对照组、溶剂对照组、肝衰竭模型组、microRNA-138抑制物组、microRNA无关序列对照组及茵陈四苓颗粒+microRNA-138模拟物组中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的表达水平结果。结果:(1)ALT、AST的生化检测结果表明,静脉注射ConA处理建立小鼠肝衰竭模型后,3-24h组动物的血清丙氨酸氨基转移酶均高于对照组(P<0.05),6-24h组动物的血清丙氨酸氨基转移酶均高于M1h组(P<0.05)。同样,3-24h组动物的血清天门冬氨酸氨基转移酶均高于对照组(P<0.05),6-24h组动物的血清天门冬氨酸氨基转移酶均高于M1h组(P<0.05)。(2)组织病理学检测结果表明,ConA静脉注射小鼠肝组织1h后出现多型核白细胞浸润,未见明显的坏死灶存在。ConA静脉注射小鼠肝组织3h后,可见少量小的、散在的坏死灶,多型核白细胞数量增多。ConA静脉注射小鼠肝组织6h后,坏死灶的面积和数量均明显增加。ConA静脉注射小鼠肝组织12h后,坏死灶面积增加,相互接呈片状。ConA静脉注射小鼠肝组织24h后,肝组织可见大片坏死灶,并伴有门静脉充血和凝血现象发生。(3)RT-qPCR检测结果表明,ConA静脉注射诱导的小鼠急性肝衰竭的肝组织中,microRNA-138的mRNA表达水平逐渐降低,其表达受到抑制,0-6h下降最快,每个时间点间差异均有统计学意义(P<0.05),且与正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。随后下降趋势变缓。TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表达水平逐渐增高,表达受到上调。TNF-α的mRNA表达水平在ConA静脉注射后1h表达量急剧上升,随后开始下降,1-12h下降速度较快,每个时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。12-24h下将速度减缓,24h已经接近正常水平(P>0.05)。IL-6的mRNA表达水平在ConA静脉注射后1h表达量急剧上升,随后开始下降,每个时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-1β的mRNA表达水平在ConA静脉注射后1h表达量缓慢上升至24h,每个时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)体外实验结果表明,空白对照组、溶剂对照组、microRNA无关序列对照组中microRNA-138、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表达水平结果相似,差异无统计学意义(P>0.05)。肝衰竭模型组与空白对照组相比,microRNA-138的mRNA表达水平显著下降(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA的表达水平显著上调(P<0.05),差异有统计学意义。microRNA-138抑制物组中,由于加入microRNA-138抑制物,与空白对照组和肝衰竭模型组相比,microRNA-138的mRNA表达水平显著下降(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA的表达水平显著上调(P<0.05),差异有统计学意义。与肝衰竭模型组相比,茵陈四苓颗粒+microRNA-138模拟物组,microRNA-138的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA的表达水平显著下降(P<0.05),差异有统计学意义。(5)用ELISA检测细胞培养液上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的表达水平,空白对照组、溶剂对照组、microRNA无关序列对照组中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的表达水平结果相似,差异无统计学意义(P>0.05)。肝衰竭模型组与空白对照组相比,TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白的表达水平显著上调(P<0.05),差异有统计学意义。microRNA-138抑制物组中,由于加入microRNA-138抑制物,与空白对照组和肝衰竭模型组相比,TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白的表达水平显著上调(P<0.05),差异有统计学意义。与肝衰竭模型组相比,茵陈四苓含药血清+microRNA-138模拟物组,TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),差异有统计学意义。结论:(1)ConA静脉注射可以诱导建立小鼠急性肝衰竭模型,静脉注射1h后就会引起血清AST、ALT的明显变化。3h后即可出现少量较小的、散在的坏死灶。随着时间的延长,肝细胞坏死情况越严重。(2)ConA静脉注射诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝组织中,microRNA-138的mRNA表达随着小鼠肝衰竭情况的加重,其表达水平逐渐降低,其表达和功能受到抑制。TNF-α和IL-6的mRNA表达水平在造模1h后就会急剧上升,随后缓慢下降。而IL-1β的mRNA表达水平呈现出逐渐增高的趋势。(3)microRNA-138 mRNA表达受到抑制时,炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平升高;而microRNA-138 mRNA表达水平升高时,炎症因子的表达水平是下降的,由此说明microRNA-138在调控肝脏巨噬细胞炎症因子表达方面有一定的作用。(4)茵陈四苓颗粒联合microRNA-138能使肝脏巨噬细胞的炎症因子表达下调,由此推测茵陈四苓颗粒联合microRNA-138在抑制急性肝衰竭肝脏巨噬细胞炎症因子的表达中起了一定的作用,有助于抑制肝衰竭时肝脏巨噬细胞的炎症反应,从而避免进一步的免疫炎症损伤。