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多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种自身免疫性脱髓鞘疾病,炎症性脱髓鞘和轴突损伤是其慢性阶段的病理标志,会导致严重的神经功能障碍。虽然目前所使用的对MS进行治疗的方法,在降低疾病严重程度和进程方面取得了很大的进步,但仅在MS急性疾病而非慢性疾病中表现出一定的疗效,因此有必要进一步开展相关研究。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE）模型,可以反映MS的很多病理学特征,是MS的经典实验动物模型。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG35-55)多肽诱导C57BL/6小鼠形成的EAE模型,可造成中枢神经系统（Central nervous system,CNS）中脊髓明显的炎性脱髓鞘病变,病情稳定,容易诱导,被广泛应用于MS的研究中。在CNS中,由少突胶质细胞（oligodendrocytes,OLs）形成髓鞘。髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）是髓鞘的重要结构蛋白。有研究表明,通过免疫前腹膜内注射MBP可抑制成年Wistar大鼠EAE的产生,这表明MBP可以抑制EAE的发生。基于这个原理,在本研究中,通过在EAE小鼠模型中,对OLs中MBP进行过表达,进而促进髓鞘的再生,以达到缓解EAE病情的目的。腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）能够穿过血-脑屏障,具有细胞靶向性和很高的稳定性,能够感染分裂和未分裂的细胞。不同血清型AAV可靶向不同的组织细胞,再配合相应的特异性启动子,可以实现比较精准的组织细胞定位。因此,在本研究中,构建靶向OLs对MBP进行过表达的AAV载体,通过尾静脉注射,使EAE小鼠模型脊髓中的OLs对MBP进行过表达。为了进一步探讨EAE的病理机制以及过表达MBP对EAE的影响,本研究用MOG35-55多肽与完全弗氏佐剂（complete freund’s adjuvant,CFA）诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型。免疫后第7天、14天、21天、28天,分别对小鼠进行病情评价,取脊髓组织进行HE染色、LFB染色和免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR分析,以进一步探讨EAE的病理机制。以免疫后第14天明显发病的EAE模型小鼠作为干预对象。分别对各EAE模型小鼠尾静脉注射,靶向OLs对MBP进行过表达的AAV载体,在注射AAV载体后的2周、4周、6周,分别对各小鼠进行病情评价,取脊髓组织进行HE染色、LFB染色和免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR分析,以评价在OLs中对MBP进行过表达对EAE髓鞘的影响。实验结果显示如下:1)EAE模型的建立与评价（1）病情评价结果显示,免疫后第10天,实验小鼠开始陆续发病,直至免疫后21天症状达到高峰,出现尾巴瘫痪,双侧后肢瘫痪,依靠前肢爬行的临床表现。之后症状稳定未再加重也没有明显的恢复,直至免疫后28天小鼠仍表现为严重的残疾状态,其症状表现符合经典EAE模型临床特点。（2）HE染色和LFB染色结果显示,与对照组小鼠相比,EAE小鼠免疫后7天,脊髓白质内极少有炎性细胞浸润,没有明显的髓鞘脱失;免疫后第14天,EAE小鼠脊髓白质区域较多炎性细胞浸润,出现点状髓鞘脱失;免疫后第21天和28天,EAE小鼠脊髓白质区域大量炎性细胞浸润形成袖套状结构改变,出现多个大小不一的片状脱髓鞘区域,是EAE模型的典型病理特征。（3）免疫荧光染色结果显示,EAE小鼠髓鞘标记物MBP和PLP1、轴突标记物NF200、少突胶质细胞标记物NGFRp75的阳性标记在免疫后第14天、21天、28天均低于对照组,巨噬细胞标记物CD68的阳性标记在免疫后第14天、21天、28天均高于对照组;表明EAE小鼠发病后会造成髓鞘脱失,轴突和OLs损伤,炎性细胞浸润。（4）实时荧光定量PCR结果显示,免疫后第7天、14天、21天、28天,MBP、PLP1、NGFRp75、Olig2的m RNA相对表达量呈现显著下降趋势,IFN-γ、IL-17、IL-10的m RNA呈现显著上升趋势,免疫后第14天,21天,28天,NF200的m RNA相对表达量显著降低。提示在EAE病症发展的过程中,髓鞘轴突受到破坏,OLs损伤,炎性细胞参与炎症反应,导致髓鞘严重破坏。2)调节MBP过表达对EAE小鼠干预评价（1）分别在注射AAV 2周,4周和6周,取脊髓进行冰冻切片,直接用荧光显微镜观察,结果显示,在上述各时间点均能观察到AAV自身携带的荧光标记,这表明,本研究中所使用的AAV能够透过血脑屏障并感染脊髓。（2）实时荧光定量PCR分析结果显示,与正常小鼠相比,注射了对MBP过表达AAV载体的正常小鼠的脊髓,在注射AAV 2周,4周和6周,其MBP的表达量均升高,这提示,本研究中所使用的AAV载体能够在脊髓中对MBP进行过表达。（3）病情评价结果显示,注射AAV 2周,各组平均体重没有显著差异,注射AAV 4周、6周,MBP过表达组体重显著高于模型组、空载组;注射AAV 2周、4周、6周,MBP过表达组神经功能评分显著低于模型组、空载组。这提示,MBP过表达,能够改善EAE小鼠的病情。（4）HE染色和LFB染色结果显示,注射AAV 2周,各EAE小鼠没有表现出形态学显著差异;注射AAV 4周、6周,MBP过表达组炎性细胞浸润水平、髓鞘脱失水平均显著低于模型组、空载组。这提示MBP过表达,能够改善EAE小鼠炎性细胞浸润和髓鞘脱失。（5）免疫荧光染色显示:注射AAV 6周,模型组、空载组、MBP过表达组与对照组相比,出现不同程度的髓鞘脱失、轴突损伤、炎性细胞浸润现象,其中模型组和空载组比较严重,表明EAE小鼠病情没有康复,还在缓解恢复中,各实验组缓解恢复程度不同。（6）实时荧光定量PCR结果显示:注射AAV 2周、4周、6周,MBP过表达组与模型组、空载组相比可一定程度上调NF200、Olig2、NGFRp75、MBP、PLP1、IL-10基因m RNA的表达,下调IFN-γ、IL-17基因m RNA的表达。由于Olig2、NGFRp75是OLs的标记物,NF200是轴突的标记物,MBP和PLP1是髓鞘的标记物,IL-10是抑炎因子,IFN-γ和IL-17是促炎因子,上述实验结果提示,MBP的过表达,对轴突、OLs和髓鞘的再生具有促进作用,对EAE的炎性反应具有缓解作用。综上实验结果表明:通过MOG35-55多肽与CFA诱导C57BL/6小鼠可成功建立EAE动物模型,此模型具有良好的稳定性,且操作简便可靠。在AAV调节OLs中MBP过表达干预EAE小鼠后,MBP过表达能够改善EAE小鼠的病情,还能改善EAE小鼠脊髓组织炎性细胞浸润水平和髓鞘脱失水平;此外,MBP的过表达,对轴突、OLs和髓鞘的再生具有促进作用,对EAE的炎性反应具有缓解作用。