体色是动物群体与群体、个体与个体之间识别的最直观的特征,同时它也深刻的影响着生物体的生存和繁衍。影响生物体色的原因有很多种,主要分为物理因素和化学因素,前者主要通过动物本身的一些特殊结构对光线进行折射或散射产生色彩,后者主要通过不同的色素细胞合成不同的色素颗粒的方式产生色彩。目前,已经开展了很多脊椎动物体色形成相关的研究,在人类皮肤病形成、鸟类不同色彩形成和两栖爬行动物变色机制等方面都进行了相关的研究。鱼类体色的研究主要集中在斑马鱼和青鳉等模式生物,对其他鱼类研究较少。黑色素的合成通路主要包括α-MSH/MC1R信号通路、SCF/c-Kit通路、Wnt通路和内皮素通路。在人类与骆驼中KIT与KITLG是SCF/c-Kit通路中的关键基因,已有的研究表明该通路对黑色素细胞的分化、迁移、增殖及色素合成等方面具有重要作用,KIT功能异常是斑驳病与白癜风的成因之一。真骨鱼类由于其特有的第三轮全基因组复制,kit基因有两个复制,分别为kita与kitb,kitlg基因也拥有两个复制,分别为kitlga与kitlgb。敲降kita或kitlga也会导致斑马鱼黑色素细胞数量减少,结合表达定位证实kita的配体基因为kitlga而不是kitlgb,突变kita早期会使斑马鱼黑色素细胞大量缺失,但是在晚期会有一定的恢复;突变青鳉kitlga基因会导致黑色素细胞和白色素细胞的数量减少,并证实kitlga突变是fm突变体形成的原因;孔雀鱼中对kita的研究显示kita与黑色素细胞增殖分化有关。目前,还未见鱼类不同发育时期kita和kitlga基因的表达变化的研究,在其他鱼类也未见有关kita及其配体突变体的研究,更无kita和kitlga双突变对鱼类体色斑图形成的影响的报道。尼罗罗非鱼是世界性养殖鱼类,拥有黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞和虹彩细胞四种色素细胞,且拥有与斑马鱼和青鳉等模式生物不同的黑色竖纹模式,目前还没有黑色素细胞对其体色形成作用和机制的相关报道。本研究对罗非鱼KIT和KITLG进行了系统演化分析,通过RT-PCR、q RT-PCR和荧光原位杂交技术探究了kita与kitlga基因不同时期的表达模式和早期表达定位,再使用CRISPR/Cas9基因编辑技术首次在尼罗罗非鱼中建立了kita与kitlga的单突变系和双突变系,开展对kita与kitlga基因功能的研究,探讨其在罗非鱼体色形成中的作用,主要研究结果如下:1)分析了KIT和配体KITLG在脊椎动物中的演化情况。从尼罗罗非鱼分离了kit和kitlg的复制基因,并通过脊椎动物2R、3R、4R的物种进化分析,探讨它们的系统演化规律。2)分析了kita和kitlga在罗非鱼中的表达模式。q RT-PCR和RT-PCR显示,kita与kitlga基因在早期胚胎中的表达模式相似,二者在去除眼睛的5 daf-10 daf小鱼全胚中的表达呈现出降低的趋势;而在20 dpf、30 dpf、60 dpf、90 dpf和180dpf的皮肤中呈现出升高的表达趋势。对10 dpf的小鱼的整鱼切片荧光原位杂交显示二者皆在骨骼周围和皮肤显示出荧光信号,但是二者的功能又存在部分的不同。因此我们推测kita的配体基因为kitlga但不止是kitlga,kitlga也不仅仅只是通过与kita的结合发挥作用。3)建立了罗非鱼kita和kitlga的单、双突变系并分析了它们在体色形成中的作用。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼kita第二外显子和kitlga第二外显子处,设计靶点,合成g RNA与Cas9,注射并成功实现kita与kitlga的突变,获得了F0代单突变阳性鱼;再将各自的F0代阳性雄鱼与普通雌鱼交配传代,通过对后代鱼kita、kitlga基因的特异性扩增和测序筛选检测得到F1代单突变阳性鱼;选取F1代各自单突变阳性鱼中发生移码突变或转录提前终止且突变基因型相同的雌雄个体传代,筛选子代得到F2代单突变阳性纯合子。双突变系的建立是通过kita纯合突变雌性与kitlga纯合突变雄性杂交,通过筛选得到双突变的F1代雌、雄个体;通过F1代双突变个体的雌、雄杂交,筛选得到F2代双突变纯合子。目的基因突变体的连续显微观察和拍摄发现kita、kitlga单突变F0代阳性鱼中黑色素细胞数量大量减少,同时伴随不同程度的条纹缺失;在F1代,kita、kitlga单突变及其双突变阳性鱼均无明显表型;F2代中,kita、kitlga纯合突变与双突变体胚胎期黑色素细胞大量减少,并且黑色素母细胞不再向身体中迁移,身体中最初出现的黑色素细胞也不再继续增殖;稚鱼期身体皮肤中的黑色素细胞基本缺失,同时伴随着所有条纹的消失和腹膜黑色素细胞的缺失;成鱼期均出现一定程度的黑色素细胞恢复,皮肤中新形成的黑色素细胞数量稀少且呈均匀分布,不能聚集成竖状条纹,腹膜中始终不存在黑色素细胞,但视网膜色素上皮中的黑色素细胞始终和野生型相似。所以我们认为腹膜中的黑色素细胞对kita和kitlga基因的作用依赖性很强,任一基因功能缺失都会导致腹膜部位黑色素细胞的缺失且不能恢复,但视网膜色素上皮的黑色素发生始终不受kita和kitlga的影响,可能拥有和身体中的黑色素细胞不同的起源。通过对尾鳍和鳞片中的黑色素细胞计数发现,与野生型相比kita突变体尾鳍和鳞片中黑色素细胞数量显著减少,但鳞片中的黄色素细胞显著增加,这可能是因为二者起源于共同的前体细胞所致;kitlga突变体鳞片和尾鳍基本不存在黑色素细胞,表型较kita更为明显,有趣的是,kitlga突变体鳞片中的红色素细胞显著增加、尾鳍中的虹彩细胞疑似也有增加。综上所述,尼罗罗非鱼具有两个kit（kita和kitb）基因和两个kitlg（kitlga和kitlgb）基因。其中kitlga和kita的表达模式与表达定位基本一致,kita/kitlga任一基因功能的缺失都会影响黑色素细胞的增殖能力,使身体黑色素细胞显著减少,但是视网膜色素上皮中的黑色素细胞不受影响;晚期的纯合单突变鱼表现出一定的黑色素细胞数量的恢复;kita突变体在抑制黑色素细胞数量的同时会增加黄色素细胞的数量;kitlga突变对黑色素细胞的表型比kita明显,并且其突变体在抑制黑色素细胞数量的同时还增加了红色素细胞的数量,甚至有可能影响了虹彩细胞的数量,其中的机制还有待进一步的研究。