拟南芥过氧化物酶编码基因GSM6的鉴定及特性分析

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葡萄糖(Glucose,Glc)是植物生长和发育的能量来源,其代谢过程中产生的NADH,ATP及各种产物对于植物的整个生长周期极为重要,并且它还可以作为一种信号分子,调控植物的各个生理过程。在拟南芥中,己糖激酶1(Hexokinase 1,HXK1)不仅参与糖酵解催化葡萄糖磷酸化成6-磷酸葡萄糖,而且作为葡萄糖感受器感知和接受糖信号。过去的研究通过对大量的拟南芥葡萄糖敏感/不敏感突变体的分析,逐步揭示了植物中的葡萄糖信号调控网络。本实验室的前期研究,筛选并鉴定到四个拟南芥葡萄糖敏感突变体(gsm1、gsm2、gsm3和gsm5)。且对其基因相关功能分析发现GSM1,GSM3和GSM5这三种蛋白功能都与葡萄糖诱导的ABA信号途径相关,而GSM2蛋白则是在维持ROS稳态中扮演了重要角色。在本研究中,通过高效的突变体筛选系统,筛选并鉴定了一个拟南芥葡萄糖敏感突变体gsm6(Glucose-sensitive mutant 6)。并通过遗传和分子生物学方法研究了GSM6基因在植物生长和发育过程中的功能,获得的主要结果如下:(1)在高浓度的葡萄糖处理下,gsm6突变体相较于野生型表现出敏感表型。即其种子萌发率和子叶膨大率皆受到明显抑制,且其敏感表型随葡萄糖浓度的增加而加剧。(2)通过基因型鉴定和RT-PCR分析,证实了gsm6是一个转录本缺失纯合突变体,并且在gsm6突变体中过表达GSM6基因的编码序列(Coding sequence,CDS),能够回复gsm6突变体在葡萄糖处理下种子萌发和子叶膨大受抑制的表型。(3)通过RT-PCR以及GUS染色方法分析GSM6基因的组织表达模式,发现GSM6基因在所有被测组织中均有表达,并且葡萄糖能够被诱导GSM6基因的表达。(4)GSM6基因编码一个过氧化物酶,并且对GSM6蛋白进行亚细胞定位分析,发现GSM6定位于植物细胞壁。(5)通过叶绿体自发荧光检测,发现gsm6突变体叶片中的叶绿体自发荧光明显低于野生型。并且,通过叶绿素含量测定以及卢戈氏碘液染色,发现与野生型相比,gsm6突变体叶片中的叶绿素以及淀粉含量都有明显降低。同时,通过qRTPCR方式检测了gsm6突变体中叶绿素相关基因的表达,发现gsm6突变体中叶绿素合成或降解相关基因都有下调。(6)通过DAB与NBT染色发现,在3%葡萄糖处理下,gsm6突变体相比野生型积累了更多的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。并利用qRT-PCR方式分析gsm6中抗氧化相关基因的表达,发现部分抗氧化相关基因的表达水平明显高于野生型。综上所述,本研究筛选并鉴定得到一个对Glc敏感的gsm6突变体。葡萄糖能诱导GSM6基因的表达,且GSM6蛋白被发现定位于细胞壁。与野生型相比,gsm6突变体积累相对更多的高糖诱发的ROS。由此推测,GSM6可能在植物维持ROS稳态的过程中发挥了一定的作用。
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