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研究目的1.总结俞超芹教授治疗“肾虚肝郁证”PCOS性不孕症患者的用药规律和学术思想;2.观察PCOS性不孕症患者卵巢颗粒细胞线粒体功能;3.从颗粒细胞线粒体功能角度探讨优化俞氏清肝方对PCOS模型大鼠的治疗作用及可能的作用机制;4.初步探索优化俞氏清肝方对PCOS模型大鼠的干预对PCOS子代的影响。方法1.通过对肾虚肝郁证PCOS性不孕症的最终成功妊娠产子的患者的病历处方进行整理,使用SPSS 22.0进行频次和聚类分析;使用IBM SPSS Modeler 18进行关联规则分析;使用Gephi 0.9.2进行复杂网络分析。2.提取和培养PCOS性不孕症患者颗粒细胞,采用HE染色、免疫荧光染色鉴定,体外增殖实验,进行颗粒细胞鉴定及活力测定;通过ATP试剂盒测定ATP、RT-PCR法测定mt DNA拷贝数,观察PCOS性不孕症患者颗粒细胞线粒体功能。3.制备并筛选PCOS大鼠模型,分别给予生理盐水、螺内酯、优化俞氏清肝方干预,通过阴道上皮细胞形态观察大鼠的性周期、ELISA法测血清性激素、镜下观察及HE染色观察卵巢组织形态病理学改变;将不同处理组PCOS模型大鼠进行合笼交配实验,观察不同处理组GD18胚胎情况以及仔鼠一般情况和生长发育情况;采用PD4平面翻正反射、PD6断崖回避反射实验,评估大鼠子代的早期神经行为发育情况;通过旷场实验,评价大鼠子代自发和探究活动及焦虑状态。4.制备并筛选PCOS大鼠模型,提取并培养大鼠颗粒细胞,HE染色、免疫荧光染色进行颗粒细胞鉴定;透射电镜观察颗粒细胞超微结构;采用ATP试剂盒测定线粒体ATP,RT-PCR法测定mt DNA拷贝数、DNA4834bp缺失以及OXPHOS相关功能基因m RNA表达情况,WB法测功能基因蛋白表达。结果1.高频药物共有20味,按照种类功效分类,补虚药、清热药和活血化瘀药,使用频率最高。二项关联规则中,生地和当归配伍使用频率最高。聚类分析结果结合专业知识分为10类,药物复杂关系结果可见当归、白芍、桑椹和郁金为处方集的核心药物。2.人卵巢颗粒细胞为贴壁细胞,24-36小时贴壁,细胞的增殖顶峰在48-72小时间,贴壁形态为放射状星形。免疫荧光染色FSHR的特异性表达阳性＞95%。PCOS组（n=15）卵巢颗粒细胞ATP产量3.83±0.60（μM）小于对照组（n=10）6.12±0.68（μM）（P＜0.05）;PCOS组（n=10）卵巢颗粒细胞mt DNA拷贝数0.60±0.05小于对照组（n=10）0.99±0.07（P＜0.05）。3.动物实验显示,不同干预措施处理28天后,螺内酯组和优化俞氏清肝方组的大鼠血清T较PCOS组（M）显著下降（P＜0.05）,优化俞氏清肝方组的大鼠血清LH显著低于PCOS组（P＜0.05）。螺内酯组和优化俞氏清肝方组的卵巢HE切片中可见发育的卵泡和黄体,颗粒细胞较对照组层数和密度增加,但也同时存在少量无卵母细胞的空泡。优化俞氏清肝方组的肝脏形态和病理形态学观察无明显异常。GD18天解剖观察,优化俞氏清肝方组的平均胚胎重量大于PCOS组和对照组。各处理组活产率均为100%,优化俞氏清肝方组未见畸形仔鼠。优化俞氏清肝方组的大鼠子代,4天和21天体重、PD8门齿萌出率均高于同时期PCOS组。不同干预措施处理后的四组大鼠子代,PD4平面翻正反射成功率、PD6断崖回避反射成功率、血清性激素DHEA-S水平,组间两两比较,无统计学差异（P＞0.05）;旷场实验观察中,四角+边上活动路程分析,螺内酯组的子代大鼠高于其他三组（P＜0.05）,在其他路程、各项时间及站立次数的组间两两比较,均无统计学差异（P＞0.05）。模型组、螺内酯组、中药组的T水平均高于对照组,有统计学差异（P＜0.05）,三组之间两两比较无统计学差异（P＞0.05）。4.大鼠卵巢颗粒细胞约48小时贴壁,免疫荧光染色FSHR的特异性表达阳性＞95%。电镜观察卵巢颗粒细胞,PCOS组见较多异常线粒体。PCOS组无明显mt DNA4834bp缺失。与对照组相比,PCOS组NDUFB8、ATP5jm RNA表达水平显著降低（P＜0.05）。经优化俞氏清肝方组药物干预后,大鼠卵巢颗粒细胞ATP水平（2.54±0.26μM）较PCOS组显著提高（1.67±0.18μM）（P＜0.05）;PCOS组的ATP5jm RNA的表达量（0.75±0.15）较PCOS组（0.40±0.17）显著增高（P＜0.05）,其蛋白表达趋势相同。结论1.俞超芹教授治疗“肾虚肝郁证”PCOS性不孕症的诊疗特点有:育肾清肝,调经助孕;由博返约,提出二期诊治;注重沟通,身心同治;2.PCOS性不孕症患者卵巢颗粒细胞存在线粒体功能异常;3.优化俞氏清肝方对PCOS模型大鼠具有一定程度的治疗作用,可促进模型大鼠卵泡发育,改善其生殖能力,安全性较好;优化俞氏清肝方对PCOS模型大鼠的孕前预干预,能提高受孕率,降低流产率,且未见明显致畸风险,其子代的生长发育和神经行为发育无明显影响。4.PCOS模型大鼠生殖能力降低,其颗粒细胞线粒体功能和结构损伤可能是引起卵泡发育障碍、生殖能力降低原因之一;优化俞氏清肝方对PCOS模型大鼠其作用机制可能是通过上调ATP5j表达,提高ATP合成产量,从而改善了颗粒细胞的线粒体功能,进而改善了卵泡的发育,有利于妊娠。