论文部分内容阅读
目的:卵巢早衰（Premature Ovarian Failure,POF）是女性40岁之前出现卵巢功能衰竭所导致的常见妇科疾病,患者体内卵泡耗竭导致生育力完全丧失,目前的临床治疗所采取手段无法根治疾病满足患者的生育需求。近年来国内外报道了众多应用干细胞恢复卵巢功能及生育能力的基础研究成果,子宫内膜干细胞（Endometrial Stem Cells,EnSCs）在基础实验中也展现出良好的改善卵巢功能的能力,但干细胞治疗存在安全隐患和局限性,外泌体作为干细胞发挥作用的重要途径可以避免干细胞治疗的弊端,可视为POF无细胞治疗的有效候选药物。本实验拟培养EnSCs并获取常规培养外泌体（EnSCs-Exo）和优化培养外泌体（EnSCs-Met-Exo）,构建两种POF大鼠模型,观察EnSCs、EnSCs-Exo及EnSCs-Met-Exo治疗POF的效果。研究方法:1.本实验从经血中获取EnSCs对其进行形态、表面标志物及三系分化潜力鉴定。2.采用尺寸排阻法提取EnSCs-Exo,对其进行形态、粒径以及表面标志物的鉴定。3.将二甲双胍作为EnSCs的优化培养条件,观察二甲双胍浓度对外泌体产量的影响。4.构建自身免疫性POF大鼠模型和化疗损伤性POF大鼠模型,通过各组大鼠的卵巢外观形态及体积、血清中E2及FSH水平、卵巢内部形态结构及单位面积内各级卵泡数量观察EnSCs、EnSCs-Exo及EnSCs-Met-Exo治疗POF的效果。结果:1.本实验所提取EnSCs形态呈长条梭形;表达EnSCs表面标志物;具备三系分化的潜力。2.EnSCs-Exo呈外周凸中间凹的“茶杯状”形态;平均粒径为126.6nm,符合外泌体要求,且浓度较高;表达外泌体表面标志物。3.优化培养后,外泌体的产量提高。4.在自身免疫性POF模型中,模型组大鼠卵巢外观形态呈表面平滑、卵泡结构不清晰的病态,各治疗组大鼠卵巢外观形态均呈现出卵泡清晰的良好状态;模型组的卵巢体积显著降低（vs Control组,P＜0.001）,各治疗组的卵巢体积则显著增加（vs模型组,P＜0.001）;ELISA结果显示,模型组的E2水平显著降低（vs Control组,P＜0.05）,各治疗组的E2水平较模型组明显升高,EnSCs-Met-Exo治疗组的E2水平与Control组最相近（vs模型组,P＜0.05）;模型组的FSH水平显著升高（vs Control组,P＜0.01）,各治疗组的FSH水平较模型组显著降低,EnSCs-Met-Exo治疗组的FSH水平与Control组最相近（vs模型组,P＜0.01）;HE结果显示,模型组出现卵巢间质纤维化,卵泡内透明带扭曲,出现炎性细胞浸润皮质和颗粒细胞的情况,原始卵泡数量和闭锁卵泡数量显著升高（vs Control组,P＜0.001;P＜0.01）,初级卵泡和次级卵泡数量显著下降（vs模型组,P＜0.01;P＜0.05）;各治疗组卵巢卵泡腔饱满,且颗粒细胞排列较模型组规则整齐,炎性细胞浸润和间质纤维化的情况较模型组改善,原始卵泡数量和闭锁卵泡数量较模型组明显下降,初级卵泡和次级卵泡数量较模型组明显升高,EnSCs-Met-Exo治疗组各级卵泡数量与Control组最接近。在化疗损伤性POF模型中,模型组大鼠卵巢外观形态呈表面平滑、卵泡结构不清晰的病态,各治疗组大鼠卵巢外观形态均呈现出卵泡清晰的良好状态;模型组的卵巢体积显著降低（vs Control组,P＜0.001）,各治疗组的卵巢体积则显著增加（vs模型组,P＜0.001）;ELISA结果显示,模型组的E2水平显著降低（vs Control组,P＜0.001）,各治疗组的E2水平显著升高,EnSCs-MetExo治疗组的E2水平与Control组最接近（vs模型组,P＜0.001）;模型组的FSH水平显著升高（vs Control组,P＜0.01）,各治疗组的FSH水平显著升高,EnSCsMet-Exo治疗组的FSH水平与Control组最接近（vs模型组,P＜0.01）;HE结果显示,模型组出现卵巢间质纤维化,卵泡结构中透明带扭曲,颗粒细胞排列紊乱甚至断裂,原始卵泡数量和闭锁卵泡数量显著升高（vs Control组,P＜0.05;P＜0.01）,初级卵泡和次级卵泡数量显著下降（vs Control组,P＜0.01;P＜0.05）;各治疗组卵泡腔较为饱满,且颗粒细胞排列较模型组规则整齐,间质纤维化程度减轻,原始卵泡数量和闭锁卵泡数量较模型组明显下降,初级卵泡较模型组明显升高,次级卵泡数量较模型组显著升高,其中,EnSCs-Met-Exo治疗组各级卵泡数量与Control组最接近。结论:本实验成功获取EnSCs及EnSCs-Exo;二甲双胍可作为EnSCs的优化培养条件,提高外泌体的产量;EnSCs-Exo及EnSCs-Met-Exo均展现出与EnSCs一致的改善卵巢功能和治疗卵巢早衰的能力,其中,EnSCs-Met-Exo更具备进一步研究的潜力,为POF的无细胞治疗提供了新的思路。