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研究目的:构建EBP50基因的重组慢病毒表达载体,进行病毒包装后体外感染巨噬细胞,探讨EBP50对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染能力的影响,并分别从巨噬细胞吞噬体与溶酶体融合率、诱导性一氧化氮合酶表达水平和NO产生水平、巨噬细胞的自噬和凋亡水平等方面探讨EBP50影响巨噬细胞抗Mtb感染能力的相关机制。研究方法:1.重组慢病毒表达质粒的构建:采用PCR方法从质粒p LEM中扩增出EBP50基因,然后克隆进慢病毒表达质粒p Lenti-146-GFP中,构建重组慢病毒表达质粒p Lenti-146-EBP50,构建完成后经限制性内切酶酶切鉴定和测序鉴定。2.慢病毒的包装及滴度测定:分别将慢病毒表达质粒（p Lenti-146-EBP50以及对照慢病毒载体p Lenti-146-GFP和p Lenti）和慢病毒包装载体（p MD2.G和ps PAX2）共转染293T细胞,72h后收集细胞培养上清液中的慢病毒颗粒,采用超滤离心管浓缩法进行病毒颗粒的浓缩,获取重组慢病毒LV-EBP50、LV-Lenti-GFP和LV-Lenti。将浓缩后的慢病毒LV-Lenti-GFP感染RAW264.7细胞,通过流式细胞仪计数GFP阳性表达的细胞比率,明确所获慢病毒的滴度,并确定重组慢病毒感染RAW264.7细胞的最适滴度。3.重组慢病毒表达效果鉴定:重组慢病毒以MOI=10感染RAW264.7细胞,于24h、48h、72h荧光显微镜观察荧光表达,确定慢病毒表达的最佳时间,并且于最佳表达时间分别采用荧光定量RT-PCR和Western blot法检测EBP50在RAW264.7细胞中的表达。4.探讨EBP50对巨噬细胞杀伤Mtb能力的影响:采用上述重组慢病毒以MOI=10感染RAW264.7细胞,72h后再用Mtb H37Rv株对RAW264.7细胞进行感染,于Mtb感染后的不同时间点裂解细胞进行Mtb的培养、计数。5.探讨EBP50影响巨噬细胞杀伤Mtb能力的相关机制:采用上述重组慢病毒以MOI=10感染RAW264.7细胞,72h后进行指标检测:（1）EBP50对巨噬细胞i NOS表达及分布的影响:收集并裂解细胞,采用Western-blot法检测i NOS的表达水平;采用H37Rv-GFP对RAW264.7细胞进行感染,24h后采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜检测各组细胞中Mtb与i NOS的共定位情况;（2）EBP50对巨噬细胞NO产生水平的影响:收集细胞培养上清,采用硝酸还原酶法检测上清液中NO的水平;（3）EBP50对巨噬细胞内Mtb吞噬体成熟情况的影响:采用H37Rv-GFP对RAW264.7细胞进行感染,24h后采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜检测各组细胞中Mtb与溶酶体的共定位情况;（4）EBP50对巨噬细胞自噬水平的影响:收集细胞,采用Cyto-ID Autophagy detection kit自噬检测试剂盒通过流式细胞术检测细胞的自噬水平;裂解细胞,采用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达变化;（5）EBP50对巨噬细胞凋亡水平的影响:采用凯基Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒试剂盒通过流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡水平。研究结果:1.酶切和测序结果显示成功构建了重组慢病毒表达质粒p Lenti-146-EBP50。2.成功获取了重组慢病毒LV-EBP50、LV-Lenti-GFP和LV-Lenti,滴度均在1.0×10~7TU/ml以上,可以用于细胞水平的研究。同时,流式细胞术的检测结果显示,重组病毒以MOI=10（病毒比细胞）的感染复数感染RAW264.7细胞72h时荧光表达最强,且细胞状态良好。3.重组慢病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR与Westernblot均能检测到EBP50的表达上调,证实重组慢病毒可成功在RAW264.7细胞中表达所携带的重组基因。4.与LV-Lenti-GFP对照组比较,LV-EBP50感染组RAW264.7细胞对Mtb的杀伤能力显著增强。5.与LV-Lenti感染组比较,LV-EBP50感染显著上调RAW264.7细胞i NOS的表达水平和NO产生量,但对巨噬细胞中Mtb与i NOS的共定位率没有显著影响。6.与LV-Lenti感染组比较,LV-EBP50感染组RAW264.7细胞的自噬水平升高,LC3的表达量也明显上调,同时,LV-EBP50感染可有效提高巨噬细胞中Mtb与溶酶体的共定位率。7.与LV-Lenti感染组比较,LV-EBP50感染组RAW264.7细胞的凋亡水平显著升高。结论:1.本研究成功构建了EBP50重组的慢病毒表达载体,并通过慢病毒包装获取了可在巨噬细胞中有效表达EBP50的慢病毒LV-EBP50。2.EBP50过表达可促进巨噬细胞对Mtb的杀伤功能。3.EBP50促进巨噬细胞对Mtb杀伤能力的机制可能与以下两方面的因素有关:（1）通过上调巨噬细胞的自噬水平,经自噬-溶酶体途径促进Mtb吞噬体与溶酶体的融合。（2）上调巨噬细胞自身的凋亡水平。