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目的1.明确THP-1源性巨噬细胞感染HCMV后,细胞自噬水平的时序性变化;2.观察HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后,AIM2炎性体通路下游效应因子IL-1β表达的时序性变化;3.确定HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后,病毒UL122基因的转录变化;4.探讨固有免疫细胞自噬与AIM2炎性体通路在抗HCMV机制中的作用。方法1.THP-1细胞分化:体外培养THP-1细胞,用PMA(100 ng/ml)刺激其分化为THP-1源性巨噬细胞,构建HCMV感染THP-1源性巨噬细胞模型。2.实验分组:(1)HCMV AD169标准毒株感染组(HCMV组);(2)热灭活HCMV感染组(Heat-HCMV组);(3)模拟感染对照组(M组);(4)雷帕霉素(rapamycin,400nmol)自噬阳性对照组(RAPA组)。病毒感染复数MOI=1。3.THP-1源性巨噬细胞自噬水平的评估(1)western blot检测自噬相关蛋白beclin1表达量和LC3转化量(LC3-II/LC3-I)在感染后1h、3h、6h、12h、24h和48h的动态变化;(2)用透射电镜观察各组细胞胞质中自噬泡形成数量,以观察感染后6h、12h和24h自噬泡数量的变化;4.ELISA法测定THP-1源性巨噬细胞IL-1β表达的时序性变化:在病毒感染细胞后1h、3h、6h、12h、24h和48h,收集细胞培养上清,用ELISA法测定HCMV组、Heat-HCMV组和M组中细胞上清IL-1β表达变化,设立poly(d A:d T)(转染24h)为阳性对照组。5.病毒UL122基因表达水平:用real-time RT-PCR法定量测定病毒UL122基因感染THP-1源性巨噬细胞后1h、3h、6h、12h、24h和48h的转录水平变化;结果1.THP-1源性巨噬细胞自噬相关蛋白LC3转化量和beclin1表达动态变化:在HCMV感染组,THP-1源性巨噬细胞感染后1h,自噬相关蛋白beclin1表达量明显增高;LC3转化量在感染后6h明显增高;而到感染后24h和48h,beclin1表达量和LC3转化量都降低,明显低于Heat-HCMV组和RAPA阳性对照组(P<0.05)。当用Heat-HCMV处理THP-1源性巨噬细胞,beclin1在1h就开始明显高表达,LC3转化量在6h明显增高,直到感染后48h持续高表达。2.THP-1源性巨噬细胞自噬泡数量的变化:HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后6h可观察到自噬泡数目明显增加,但感染后24h明显降低;而Heat-HCMV处理THP-1源性巨噬细胞后6 h自噬泡明显增加,并持续到感染后48h;3.THP-1源性巨噬细胞IL-1β表达水平变化:HCMV感染THP-1源性巨噬细胞1h后,细胞上清IL-1β表达量逐渐显著增高,感染后3h和6h达到poly(d A:d T)阳性对照组水平(P>0.05),感染后12h、24h和48h明显高于poly(d A:d T)阳性对照组(P<0.05)。Heat-HCMV组在3h后各时间点IL-1β表达显著低于HCMV组(p<0.05)而与模拟感染组无明显差异(P>0.05)。4.HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后24 h才出现病毒UL122基因转录量明显增加,是感染后1h的2.12倍(p<0.05),至48 h达3.43倍(p<0.05)。结论1.HCMV在感染早期促进THP-1源性巨噬细胞发生自噬,但在感染24h后细胞自噬受到抑制;而灭活Heat-HCMV可持续活化细胞自噬,提示HCMV可通过抑制固有免疫细胞自噬而逃逸病毒清除;2.HCMV可诱导THP-1源性巨噬细胞持续显著高表达IL-1β,而灭活病毒无此作用,表明该效应与病毒激活THP-1源性巨噬细胞AIM2炎性体通路有关;3.与HCMV高敏感细胞HEL相比,HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后病毒即刻早期基因表达明显延迟,这可能与固有免疫细胞在感染早期发生自噬和AIM2炎性体通路被激活相关。