半滑舌鳎抗菌肽高产菌株的筛选及表达条件优化

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抗菌肽(antimicrobial peptides)是一种具有广谱抗菌活性的小分子多肽,目前已发现了大约1900种,几乎存在于所有的物种中。这种多肽具有分子量小、热稳定性好、免疫原性较低、抗菌范围广、不易产生耐药性、毒副作用小等诸多优点,在人和动物病害防治中具有重要的应用潜力。本研究以实验室已构建好的半滑舌鳎Hepcidin成熟肽的原核表达菌株为基础,对80个重组菌株进行了筛选,通过比较80个菌株蛋白表达的SDS-PAGE图谱,筛选出了蛋白表达量最多的菌株。对高效表达菌株的表达条件进行了优化,比较了该菌株在不同诱导时间、不同诱导温度、不同诱导时机和不同诱导剂浓度下表达的目的蛋白SDS-PAGE图谱,得到最佳表达条件是:诱导时机为OD600=0.6-0.7,诱导温度为30℃,诱导时间为10h,诱导剂浓度为1.0mM。将实验室已获得的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hepcidin和NK-lysin成熟肽编码基因分别连接到分泌型载体pINA1317和胞内表达型载体pINA1312中,然后将这两种表达载体分别转入解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h构建真核表达系统,通过测序的结果以及对酵母基因组序列的PCR扩增,证明了两种表达载体的构建及转化均取得了成功。载体pINA1317和pINA1312质粒的启动子是都是hp4d,不需要任何物质诱导就可以表达外源基因,而解脂耶罗维亚酵母具有安全性高,生产的成本低,表达的蛋白活性高等优点。半滑舌鳎Hepcidin和NK-lysin成熟肽编码基因解脂耶罗维亚酵母表达系统的成功构建将为以后真核表达的研究应用提供理论依据和技术支持。
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