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目的:(1)明确骨质疏松(OP)不同证型下左归丸、右归丸含药血清对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)表达的作用。(2)明确OP不同证型下左归丸、右归丸含药血清对成骨细胞ERK1/2、Wnt/β-catenin信号通路相关因子β-catenin、ERK1、ERK2mRNA及蛋白表达的作用。方法:(1)采用手术去卵巢法造成大鼠骨质疏松(OP)模型,用于OP证型下成骨细胞培养及左、右归丸含药血清制备;并在手术10周后,分别注射氢化可的松、灌胃甲状腺素造成大鼠OP肾阳虚及OP肾阴虚模型,用于OP肾阳虚、OP肾阴虚证型下成骨细胞培养及左、右归丸含药血清的制备。(2)分别用OP、OP肾阳虚、OP肾阴虚、两周龄大鼠股骨及新生24h乳鼠颅骨,进行体外成骨细胞培养,根据细胞状态及活性,筛选出符合实验要求的成骨细胞。(3)新生24h乳鼠颅骨体外培养所得的成骨细胞,以碱性磷酸酶和茜素红染色进行鉴定,测定生长曲线,考察96孔板中每孔细胞接种量,采用MTS法筛选左、右归丸含药血清对成骨细胞作用的最佳浓度及作用时间。(4)确定实验所用成骨细胞来源及含药血清作用浓度和时间后,分别用正常、OP不同证型所得的左、右归丸含药血清、空白血清干预成骨细胞,采用MTS法检测细胞增殖情况,ELISA法检测碱性磷酸酶表达,RT-PCR法检测ERK1、ERK2、β-catenin mRNA的表达,Western Blot 法检测 ERK1、ERK2、β-catenin 蛋白表达。结果:(1)实施双侧去卵巢手术10周后,组织病理学及骨密度检测结果表明骨质疏松模型成立;注射氢化可的松和灌胃甲状腺素10天后,组织病理学、外观体征及cAMP/cGMP检测表明OP肾阳虚、OP肾阴虚模型成立;(2)OP、OP肾阳虚、OP肾阴虚、两周龄大鼠股骨及新生24h乳鼠颅骨体外成骨细胞培养,虽均能得到原代细胞,但状态及活性存在明显差异。新生24h乳鼠颅骨培养所得成骨细胞的活性最强,两周龄大鼠股骨培养所得成骨细胞次之;OP、OP肾阳虚、OP肾阴虚大鼠股骨体外分离培养成骨细胞,耗时较久,细胞活力差,较易污染,且在培养9天左右死亡,无法传代。故本实验选择用24h新生乳鼠颅骨进行体外成骨细胞分离培养。(3)体外培养的大鼠成骨细胞经碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定后,证实为成骨细胞,且活性较好。根据生长曲线测定结果,取处于对数期的细胞,并以3000个/孔接种于96孔板中进行实验;MTS结果表明:20%左归丸含药血清及20%右归丸含药血清在作用72h后,对成骨细胞的促增殖作用最明显。(4)四种不同证型下(OP、OP兼肾阳虚、OP兼肾阴虚、正常状态)的左、右归丸含药血清干预成骨细胞的结果表明:四种证型下的左、右归丸含药血清均能促进成骨细胞增殖及ALP表达,且存在差异。对于左归丸而言,OP肾阴虚左归丸含药血清对成骨细胞增殖及ALP表达的促进作用最强,与正常、OP、OP肾阳虚左归丸含药血清相比,具有显著性差异(p<0.05)。对于右归丸而言,OP肾阳虚右归丸含药血清对成骨细胞增殖及ALP表达的促进作用最强,与正常、OP、OP肾阴虚左归丸含药血清相比,具有显著性差异(p<0.05)。(5)分别用四种不同证候下(OP、OP肾阳虚、OP肾阴虚、正常状态)的左、右归丸含药血清和空白血清干预成骨细胞,发现四种不同证候下的左、右归丸含药血清在调节成骨细胞β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA和蛋白的表达方面存在差异。对mRNA表达的调节具体表现为:对于左归丸而言,正常、OP、OP肾阴虚、OP肾阳虚左归丸含药血清均能上调β-catenin、ERK1 mRNA的表达,其中OP、OP肾阴虚左归丸含药血清,与相应证型下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05);正常、OP、OP肾阴左归丸含药血清能上调ERK2mRNA的表达,与相应证型下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05);OP肾阳虚左归丸含药血清,与相应证型下的空白血清比较,反而抑制ERK2 mRNA的表达。与OP肾阳虚左归丸含药血清比较,OP肾阴虚左归丸含药血清组能够显著上调β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA的表达(p<0.05)。与正常、OP左归丸含药血清比较,OP肾阴虚左归丸含药血清能够显著上调ERK1、ERK2 mRNA的表达(p<0.05),但对β-catenin的作用无明显差异。对于右归丸而言,正常、OP、OP肾阴虚、OP肾阳虚右归丸含药血清均能上调β-catenin、ERK2mRNA的表达,其中OP、OP肾阳虚右归丸含药血清在上调β-catenin、ERK2 mRNA表达方面,与相应证候下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05),OP肾阴虚右归丸含药血清在上调ERK2 mRNA表达方面,与相应证候空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05);正常右归丸含药血清与空白血清之间则无显著性差异。OP、OP肾阴虚、OP肾阳虚右归丸含药血清能够上调ERK1 mRNA表达,与相应证型下空白血清比较,具有显著性差异;与OP、OP肾阴虚右归丸含药血清比较,OP肾阳虚右归丸含药血清能够显著上调β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA表达(p<0.05);与正常右归丸含药血清比较,OP肾阳虚右归丸含药血清能够显著上调β-catenin、ERK1 mRNA表达(p<0.05)。对蛋白表达调节的具体表现为:对于左归丸而言,正常、OP、OP肾阴虚、OP兼肾阳虚左归丸含药血清均能上调β-catenin、ERK1、ERK2蛋白的表达,其中正常、OP、OP肾阴虚左归丸含药血清在上调β-catenin蛋白表达方面,与相应证候下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05),OP肾阳虚左归丸含药血清在上调ERK2蛋白表达方面,与相应证候下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05)。与OP肾阳虚左归丸含药血清比较,OP肾阴虚左归丸含药血清能显著上调β-catenin蛋白的表达(p<0.05),亦能上调ERK1、ERK2蛋白的表达,但无显著性差异。对于右归丸而言,正常、OP、OP肾阴虚、OP肾阳虚右归丸含药血清均能上调β-catenin、ERK1、ERK2蛋白的表达,其中OP、OP肾阴虚、OP肾阳虚右归丸含药血清在上调β-catenin、ERK2蛋白表达方面,与相应证候下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05),OP右归丸含药血清在上调ERK1蛋白表达方面,与相应证候下的空白血清比较,具有显著性差异(p<0.05)。与OP肾阴虚右归丸含药血清比较,OP肾阳虚右归丸含药血清能显著上调β-catenin、ERK2蛋白的表达(p<0.05)。结论:(1)本文首次研究了骨质疏松(OP)不同证型左归丸、右归丸含药血清对成骨细胞增殖分化以及ERK、Wnt信号通路相关因子mRNA及蛋白表达的影响,明确了不同骨质疏松证型下左、右归丸含药血清对成骨细胞的作用存在差异,从细胞信号通路和血清药理学层面为中医对骨质疏松症“辨证论治”、“同病异治”治则提供实验依据。(2)本文首次研究表明右归丸在OP肾阳虚证型下的含药血清对成骨细胞增殖、ALP表达、β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA及蛋白表达的促进作用最强,而左归丸在OP肾阴虚证型下的含药血清对成骨细胞增殖、ALP表达、β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA及蛋白表达的促进作用最强,这与“右归丸补肾阳、左归丸滋肾阴”的中医理论相吻合,为临床辩证治疗骨质疏松症提供科学依据。(3)左归丸、右归丸通过ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路调控成骨细胞的增殖与分化,可能是左、右归丸防治骨质疏松肾阴虚、肾阳虚证的机制之一。