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小鹅瘟(Gosling Plague,GP)是由小鹅瘟病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起的以雏鹅和雏番鸭作为侵染对象,是一种高致病性传染病并且以坏死性肠炎为主,对养鹅业的发展产生了严重的威胁。目前主要依靠弱毒疫苗免疫接种进行预防,虽然预防效果较好,但从血清学上较难区别疫苗免疫和野毒感染的动物,且理论上存在毒力反强的可能性。所以,开发安全、有效、并且能够分别出是疫苗免疫还是野毒感染显得尤为重要。VP3蛋白是GPV可以引起保护性中和抗体的糖蛋白。本试验构建了基于VP3蛋白的“自杀性”DNA疫苗,并将重组质粒免疫小鼠以及雏鹅,初步分析其免疫原性和保护效果。首先,由GenBank所登录的GPV标准株B株的序列,用Primer Premier软件针对VP3开放阅读框序列设计一对特异性引物,并在5’端添加了合适的酶切位点。提取GPV的DNA,经过PCR成功获得了VP3的基因片段。再将其克隆至甲病毒复制子载体pSCA1。通过PCR、酶切的鉴定及序列测定筛选出阳性重组质粒,并命名成pSCA-VP3。pSCA-VP3经过转化到感受态细胞Trans5α后,利用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒。再利用Lipofectamine-2000试剂盒转染pSCA-VP3至BHK-21细胞,用间接免疫荧光和Western blotting试验检测VP3蛋白在体外的表达。结果表明:构建了pSCA-VP3重组质粒;间接免疫荧光和Western blotting试验结果显示VP3蛋白能在体外获得表达,且具有良好的反应原性。其次,把30只BALB/c小鼠(6周龄)随机分为3组(10只/组),前两组分别免疫pSCA-VP3和pSCA1空载体质粒,首免剂量为100μg/只,以2周的间隔时间对小鼠进行3次免疫,剂量均为200μg/只,免疫途径为腿部肌肉注射,同时设PBS对照组。于首免后0,2,4,6周分别采集小鼠外周血分离血清,通过间接ELISA检测特异性抗体水平。免疫6周后无菌采集小鼠脾脏,进行淋巴细胞增殖试验,检测细胞免疫的水平。结果表明:pSCA-VP3能够引起小鼠产生较强的体液和细胞免疫反应,并且其免疫水平显著高于pSCA1空载体及PBS阴性对照组。最后,将无母源抗体的雏鹅(7日龄)分为4组(10只/组),分别免疫pSCA-VP3和pSCA1空载体质粒,首免剂量是100μg/只,以2周的间隔时间对雏鹅进行2免,剂量是200μg/只,肌肉注射,同时设置弱毒疫苗和PBS阴性对照组。于首免后0,2,4周采集雏鹅外周血分离血清,通过血清中和试验检测雏鹅体内中和抗体水平。二免2周后对雏鹅采集抗凝血,进行淋巴细胞增殖试验,检测细胞免疫水平。二免2周后,每组雏鹅肌肉注射GPV YZ株病毒液100ELD50,观察7天,是否出现相关临床症状。如果有死亡的雏鹅,及时进行剖检,观察相关脏器的病变。通过相关内脏组织的HE染色和免疫组化试验分析组织的病理损伤和病毒在组织内含量的情况。结果显示:pSCA-VP3和弱毒苗组的雏鹅诱导产生了中和抗体,且显著高于空载体和对照组,并且弱毒苗组的免疫效果比pSCA-VP3组更好;其细胞免疫水平高于pSCA1空载体及PBS阴性对照组。攻毒试验产生了较好的保护率,HE染色结果表明pSCA-VP3组和弱毒苗组的病理损伤小于pSCA1空载体及PBS对照组;免疫组化试验结果表明pSCA-VP3组和弱毒苗组的病毒含量明显少于pSCA1空载体及PBS对照组。综上所述,本研究构建了表达VP3蛋白的“自杀性”DNA疫苗。将p SCA-VP3免疫小鼠,检测其产生的GPV特异性抗体水平和淋巴细胞增殖反应,证明构建的重组质粒能够使小鼠产生针对GPV的体液和细胞免疫反应。表明pSCA-VP3具有开发成预防GPV的疫苗的潜力,后续进行的本体动物雏鹅的免疫效果检测也证明了pSCA-VP3具有较好的免疫效力,为GPV的疫苗研发提供了新的思路及选择,为进一步的临床应用研究提供了技术支持。