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脓毒症(Sepsis)是因感染或感染因素而导致的宿主反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍综合征，是临床创/烧伤和感染患者的常见并发症，是临床危重症患者死亡的主要原因。脓毒症的病理生理过程表现为过度的炎症反应/细胞因子风暴(cytokine storm)和免疫抑制(immunosuppression)两个阶段，二者可能同时存在，但在不同的发展阶段占据主要地位。脓毒症早期主要表现为细胞因子风暴引起的过度炎症反应，而后期主要为免疫细胞功能障碍引起的免疫抑制。目前认为，免疫抑制导致的二次感染及其多器官功能衰竭是脓毒症患者晚期死亡的主要原因，天然免疫系统和获得性免疫系统在其中均发挥重要作用。
长期以来，脓毒症的研究主要聚焦于细胞因子风暴及其造成的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，但是迄今为止尚无有效而安全的针的药物问世。近年来来自临床的报告显示，虽然病人度过前期的细胞因子风暴阶段，但是许多病人却因后期的免疫抑制导致的感染和MODS而死亡，因此人们将研究焦点又转向脓毒症免疫抑制阶段。基于脓毒症的病理生理过程，我们认为，治疗脓毒症的理想药物应当是一种良好的免疫调节剂，能够不受治疗“时间窗”的限制，即在过度炎症(细胞因子风暴)阶段发挥抗炎作用，同时能够逆转免疫抑制阶段，发挥免疫增强剂的作用。
我们课题组长期致力于脓毒症发病机制及治疗措施研究和青蒿琥酯(artesunate，AS)的药理作用及其机制研究。我们前期的研究发现AS具有良好的抗炎作用：对多种小鼠、大鼠脓毒症模型均具有良好的保护作用，显著降低动物血清的致炎因子TNF-α和IL-6水平、提高动物的存活率。在LPS耐受小鼠接受铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)二次打击的小鼠模型上中，我们发现在AS对模型小鼠具有显著的保护作用。因此，我们推测AS可能是一种具有双向免疫调节作用的免疫调节药。
在本研究中，我们采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)诱导的脓毒症免疫抑制小鼠模型、CLP二次打击小鼠模型，研究AS对CLP诱导的脓毒症免疫抑制小鼠的治疗作用。在免疫抑制小鼠模型中，检测小鼠血液、脾脏及肺脏中前炎症细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的水平；结果显示，AS显著提高免疫抑制小鼠低水平的前炎症细胞因子水平。在CLP二次打击小鼠模型中，观察小鼠7天死亡率，检测小鼠血液、脾脏及肺脏中细菌负荷量以及其前炎症细胞因子的水平；结果显示，AS显著提高模型小鼠7天生存率，提高小鼠清除细菌的能力及前炎症细胞因子水平，表明AS对CLP诱导的脓毒症免疫抑制小鼠具有显著的保护作用。
单核-吞噬细胞系统是机体抵抗病原微生物的第一道防线，在识别病原微生物、清除病原微生物以及抗原的处理、提呈中发挥重要作用，如果其功能受到抑制，则机体清除细菌能力降低。在脓毒症免疫抑制阶段，单核-吞噬细胞系统功能低下，因此恢复单核-吞噬细胞系统的正常功能对提高脓毒症患者的生存率具有重要意义。本研究采用LPS耐受单核/巨噬细胞模型，从前炎症细胞因子水平及清除细菌的能力等两方面研究AS的药理作用。在此基础上，进一步研究自噬激活剂和自噬抑制剂对LPS耐受状态的形成及AS作用的影响，并检测了AS对LPS耐受细胞自噬水平的影响；结果显示，AS对可提高LPS耐受细胞清除细菌的能力和前炎症细胞因子水平，自噬激活剂可影响LPS耐受状态的形成，自噬抑制剂可抑制AS的作用，说明LPS耐受状态的形成与细胞自噬功能降低密切相关，而AS的作用与提高细胞的自噬功能有关。
为探索参与AS作用的可能靶点与相互作用分子，本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)预测了AS相互作用候选分子。采用逆转录-聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qPCR)法及蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)筛选出相互作用分子维生素D受体(vitamin D receptor， VDR)。通过改变Vdr(敲低和过表达)检测对LPS耐受状态及AS作用的影响，并在体外实验中采用相互作用检测方法再次确认二者的相互作用。结果显示，在LPS耐受细胞中VdrmRNA及VDR蛋白的表达显著增加，而AS可显著降低其表达；改变Vdr的表达将影响LPS耐受状态的形成及AS的作用，说明VDR与LPS耐受状态的形成及AS作用密切相关。
VDR属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员，作为核转录因子，VDR的靶基因约1千多个，涉及钙磷代谢以及免疫、炎症等众多基因。研究发现，自噬形成过程中的关键基因Atg16l1为VDR的靶基因，抗菌肽Cathelicidins是VDR的直接靶基因。VDR可以通过调控Atg16l1、Cathelicidins的转录和表达从而调控细胞的自噬过程，发挥对自噬和清除细菌过程的调控作用。作为核转录因子，活化的VDR可迅速转位至细胞核，然后调节靶基因的转录活性。此外，VDR也可与核转录因子NF-κBp65发生相互作用，抑制NF-κBp65的核转位，从而抑制NF-κBp65对下游炎症因子的调控。因此，本研究从VDR对其下游靶基因的调控及其与NF-κBp65的相互作用两个方面展开研究。首先，通过WB、免疫荧光、染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation，ChIP)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)对VDR核转位、Atg16l1的转录调控及对小鼠抗菌肽(mCRAMP)调控的进行研究；然后，通过WB法、免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation，Co-IP)、ELISA对VDR与NF-κBp65相互作用进行研究。结果显示，AS可抑制VDR对其靶基因Atg16l1的转录负调控作用、对mCRAMP的调控，进而调控自噬过程；AS可以与VDR结合，从而抑制VDR的核转位并增加NF-κBp65的核转位，提高前炎症细胞因子的释放。
本研究明确了AS对脓毒症诱导的免疫抑制的保护作用，并深入研究其分子机制的研究。研究结果显示，AS可显著降低CLP诱导的免疫抑制二次打击模型小鼠的死亡率，提高CLP诱导的免疫抑制小鼠及CLP诱导的免疫抑制二次打击模型小鼠清除细菌的能力和前炎症细胞因子水平，该作用与其提高单核/巨噬细胞细胞自噬水平密切相关；AS通过与VDR相互作用，从两方面发挥逆转脓毒症诱导的免疫抑制状态：①AS与VDR相互作用，抑制VDR的核转位及其对下游靶基因Atg16l1、mCramp的调控，增强自噬相关分子的表达，增强细胞自噬过程；②AS与VDR相互作用，从而抑制VDR与NF-κBp65在细胞胞浆中的相互作用，促进NF-κBp65入核，提高致炎细胞因子基因的转录表达。
结合我们课题组前期研究，我们认为AS不仅可以在脓毒症细胞因子风暴阶段作为一个抗炎药物，发挥抗炎作用；而且能够在免疫抑制阶段作为一个免疫增强药，提高机体前炎症细胞因子水平及清除细菌的能力，发挥双向免疫调节作用。因此，青蒿琥酯值得作为一种针对脓毒症全病程的双向免疫调节药进行更深入的研究。
长期以来，脓毒症的研究主要聚焦于细胞因子风暴及其造成的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，但是迄今为止尚无有效而安全的针的药物问世。近年来来自临床的报告显示，虽然病人度过前期的细胞因子风暴阶段，但是许多病人却因后期的免疫抑制导致的感染和MODS而死亡，因此人们将研究焦点又转向脓毒症免疫抑制阶段。基于脓毒症的病理生理过程，我们认为，治疗脓毒症的理想药物应当是一种良好的免疫调节剂，能够不受治疗“时间窗”的限制，即在过度炎症(细胞因子风暴)阶段发挥抗炎作用，同时能够逆转免疫抑制阶段，发挥免疫增强剂的作用。
我们课题组长期致力于脓毒症发病机制及治疗措施研究和青蒿琥酯(artesunate，AS)的药理作用及其机制研究。我们前期的研究发现AS具有良好的抗炎作用：对多种小鼠、大鼠脓毒症模型均具有良好的保护作用，显著降低动物血清的致炎因子TNF-α和IL-6水平、提高动物的存活率。在LPS耐受小鼠接受铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)二次打击的小鼠模型上中，我们发现在AS对模型小鼠具有显著的保护作用。因此，我们推测AS可能是一种具有双向免疫调节作用的免疫调节药。
在本研究中，我们采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)诱导的脓毒症免疫抑制小鼠模型、CLP二次打击小鼠模型，研究AS对CLP诱导的脓毒症免疫抑制小鼠的治疗作用。在免疫抑制小鼠模型中，检测小鼠血液、脾脏及肺脏中前炎症细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的水平；结果显示，AS显著提高免疫抑制小鼠低水平的前炎症细胞因子水平。在CLP二次打击小鼠模型中，观察小鼠7天死亡率，检测小鼠血液、脾脏及肺脏中细菌负荷量以及其前炎症细胞因子的水平；结果显示，AS显著提高模型小鼠7天生存率，提高小鼠清除细菌的能力及前炎症细胞因子水平，表明AS对CLP诱导的脓毒症免疫抑制小鼠具有显著的保护作用。
单核-吞噬细胞系统是机体抵抗病原微生物的第一道防线，在识别病原微生物、清除病原微生物以及抗原的处理、提呈中发挥重要作用，如果其功能受到抑制，则机体清除细菌能力降低。在脓毒症免疫抑制阶段，单核-吞噬细胞系统功能低下，因此恢复单核-吞噬细胞系统的正常功能对提高脓毒症患者的生存率具有重要意义。本研究采用LPS耐受单核/巨噬细胞模型，从前炎症细胞因子水平及清除细菌的能力等两方面研究AS的药理作用。在此基础上，进一步研究自噬激活剂和自噬抑制剂对LPS耐受状态的形成及AS作用的影响，并检测了AS对LPS耐受细胞自噬水平的影响；结果显示，AS对可提高LPS耐受细胞清除细菌的能力和前炎症细胞因子水平，自噬激活剂可影响LPS耐受状态的形成，自噬抑制剂可抑制AS的作用，说明LPS耐受状态的形成与细胞自噬功能降低密切相关，而AS的作用与提高细胞的自噬功能有关。
为探索参与AS作用的可能靶点与相互作用分子，本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)预测了AS相互作用候选分子。采用逆转录-聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qPCR)法及蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)筛选出相互作用分子维生素D受体(vitamin D receptor， VDR)。通过改变Vdr(敲低和过表达)检测对LPS耐受状态及AS作用的影响，并在体外实验中采用相互作用检测方法再次确认二者的相互作用。结果显示，在LPS耐受细胞中VdrmRNA及VDR蛋白的表达显著增加，而AS可显著降低其表达；改变Vdr的表达将影响LPS耐受状态的形成及AS的作用，说明VDR与LPS耐受状态的形成及AS作用密切相关。
VDR属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员，作为核转录因子，VDR的靶基因约1千多个，涉及钙磷代谢以及免疫、炎症等众多基因。研究发现，自噬形成过程中的关键基因Atg16l1为VDR的靶基因，抗菌肽Cathelicidins是VDR的直接靶基因。VDR可以通过调控Atg16l1、Cathelicidins的转录和表达从而调控细胞的自噬过程，发挥对自噬和清除细菌过程的调控作用。作为核转录因子，活化的VDR可迅速转位至细胞核，然后调节靶基因的转录活性。此外，VDR也可与核转录因子NF-κBp65发生相互作用，抑制NF-κBp65的核转位，从而抑制NF-κBp65对下游炎症因子的调控。因此，本研究从VDR对其下游靶基因的调控及其与NF-κBp65的相互作用两个方面展开研究。首先，通过WB、免疫荧光、染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation，ChIP)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)对VDR核转位、Atg16l1的转录调控及对小鼠抗菌肽(mCRAMP)调控的进行研究；然后，通过WB法、免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation，Co-IP)、ELISA对VDR与NF-κBp65相互作用进行研究。结果显示，AS可抑制VDR对其靶基因Atg16l1的转录负调控作用、对mCRAMP的调控，进而调控自噬过程；AS可以与VDR结合，从而抑制VDR的核转位并增加NF-κBp65的核转位，提高前炎症细胞因子的释放。
本研究明确了AS对脓毒症诱导的免疫抑制的保护作用，并深入研究其分子机制的研究。研究结果显示，AS可显著降低CLP诱导的免疫抑制二次打击模型小鼠的死亡率，提高CLP诱导的免疫抑制小鼠及CLP诱导的免疫抑制二次打击模型小鼠清除细菌的能力和前炎症细胞因子水平，该作用与其提高单核/巨噬细胞细胞自噬水平密切相关；AS通过与VDR相互作用，从两方面发挥逆转脓毒症诱导的免疫抑制状态：①AS与VDR相互作用，抑制VDR的核转位及其对下游靶基因Atg16l1、mCramp的调控，增强自噬相关分子的表达，增强细胞自噬过程；②AS与VDR相互作用，从而抑制VDR与NF-κBp65在细胞胞浆中的相互作用，促进NF-κBp65入核，提高致炎细胞因子基因的转录表达。
结合我们课题组前期研究，我们认为AS不仅可以在脓毒症细胞因子风暴阶段作为一个抗炎药物，发挥抗炎作用；而且能够在免疫抑制阶段作为一个免疫增强药，提高机体前炎症细胞因子水平及清除细菌的能力，发挥双向免疫调节作用。因此，青蒿琥酯值得作为一种针对脓毒症全病程的双向免疫调节药进行更深入的研究。