牛分枝杆菌在牛和多种家养、野生哺乳动物及人类中都能引发结核病。牛结核的感染在世界范围内普遍存在,对于人类和动物健康、农业的经济可持续性和野生动物的保护构成重大挑战。虽然诸多发达国家正在实施结核病控制根除计划,但野生动物为宿主可能对根除计划的实施造成困扰。预防是目前结核病防治的重要方向,卡介苗(BCG)是世界上唯一被认可临床接种的结核病预防性疫苗,但BCG保护效率主要局限在幼年人群,对于不同年龄段存在差异性(0～85%不等),而且BCG的接种对于家畜的常规检疫存在一定的影响,因此,高效的新型结核病疫苗的开发是防治工作的首要任务。病毒载体疫苗是如今疫苗研制的热门方向,而腺病毒(Adenovirus)以易于产生高滴度,能高效将DNA导入宿主细胞,体内不易被补体灭活等优势,成为了人类基因治疗方案的优势载体。因此,本研究使用Ad为载体,构建表达牛分枝杆菌重要的细胞外分泌抗原CFP10、ESAT6、CFP7的融合基因重组腺病毒,并分析cfp10-esat6-cfp7融合基因重组腺病毒在小鼠中的免疫原性,从而为研制新型牛结核病疫苗奠定基础。本研究通过以p MD-cfp10-esat6-cfp7质粒为模板,用基因cfp10的上游引物、基因cfp7的下游引物大量扩增融合基因cfp10-esat6-cfp7,纯化后用Hind III及Eco R I酶切并回收。再与腺病毒穿梭载体pac Ad5 CMVK-Np A进行连接,成功构建了重组穿梭质粒pac Ad5 CMV-cfp10-esat6-cfp7,并将构建的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pac Ad5 9.2-100进行线性化后,共转染入人肾源细胞HEK293内,成功地包装出重组腺病毒r Ad5 CMV-cfp10-esat6-cfp7,进一步通过提取其基因组DNA,运用PCR检测融合基因cfp10-esat6-cfp7重组腺病毒的包装情况。再通过RT-PCR、间接免疫荧光等技术,证明了目的基因cfp10-esat6-cfp7在m RNA水平和蛋白水平上检成功获得了表达。将获得的重组腺病毒r Ad5CMV-cfp10-esat6-cfp7免疫小鼠,并通过流式细胞术分析,重组腺病毒r Ad5CMV-cfp10-esat6-cfp7免疫鼠CD4~+T与CD8~+T淋巴细胞水平与BCG相近,显著不差异(P﹥0.05)。重组腺病毒r Ad CMV-cfp10-esat6-cfp7组分泌IL-2细胞数量低于BCG组,差异不显著(P﹥0.05),高于0.9%Na Cl组和r Ad5 CMVK-Np A组,差异显著(P﹤0.05)。分泌TNF-ɑ数量高于BCG组,差异不显著(P﹥0.05),显著高于0.9%Na Cl组(P﹤0.05)。分泌IL-12数量高于BCG和生理盐水组,差异显著(P﹤0.05)。利用酶联免疫吸附试验检测到重组腺病毒r Ad5CMV-cfp10-esat6-cfp7免疫组小鼠血清中Ig G抗体水平显著高于0.9%Na Cl组与r Ad5 CMVK-Np A组(P﹤0.05)。可见,重组腺病毒r Ad5 CMV-cfp10-esat6-cfp7能够诱导小鼠体内产生一定水平的细胞免疫和体液免疫,为新型牛结核病疫苗的研制提供了依据。