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内蒙古白绒山羊是产绒量和绒纤维品质都位居世界前列的山羊品种，其绒产量约占中国的一半以上，占世界羊绒产量的1/3。山羊绒作为内蒙古白绒山羊最重要的经济组成部分，是一类稀缺珍贵的动物资源，在国际上享有盛誉。但由于国际羊绒市场需求量大，各产区纷纷以提高产量为目的进行杂交扩繁，导致羊绒品质急速下降，使种质资源被严重破坏。传统生物学育种也面临着优良种系存栏少、繁育周期长等问题，而基因编辑技术的应用为大动物育种提供了新的方向。
角蛋白关联蛋白(keratin-associated protein ，KAP)是角蛋白的重要组成成分，对毛发等皮肤衍生物的形成和结构有着重要影响。研究发现KAP13-1的调控基因角蛋白关联蛋白基因(keratin-associated protein，KRTAP)13-1参与了毛囊的早期发育，并对绒毛纤维直径产生影响。本实验利用CRISPR/Cas9系统制备KRTAP13-1基因敲除绒山羊，探究KRTAP13-1基因对于毛囊发育和纤维直径的影响，为培育超细绒型绒山羊育种新材料提供理论依据和研究基础。
1、载体构建
在KRTAP13-1基因的编码序列(Coding sequence，CDS)区域内设计了4对gRNA，并构建了Cas9/gRNA共表达载体。经Surveyor酶切检测和位点分析，选用3号Cas9/gRNA共表达载体完成本次实验。
2、单克隆细胞系的筛选
本次实验分别利用流式细胞仪分选法和口吸管分选法，将转染48h后的绒山羊胎儿成纤维细胞分选到96孔板中进行单细胞系培养。共获得100株单克隆细胞系，其中17株实现KRTAP13-1单等位基因敲除，敲除效率为17%；3株实现KRTAP13-1双等位基因敲除，敲除效率为3%。
3、KRTAP13-1基因定点敲除绒山羊的制备
本次实验从屠宰场采集卵巢979个，利用机械切割的方法共得到卵母细胞5542个，经过体外培养后获得成熟卵母细胞2971个，成熟率为53.6%。成熟的卵母细胞利用KRTAP13-1敲除细胞系进行克隆，经电融合后形成重构胚1928枚，其中卵裂的重构胚为1154枚，卵裂率为59.8%。将重构胚通过胚胎移植移入170只受体母羊的输卵管中，妊娠后得到7只羊羔，经鉴定其中3只羊羔实现了KRTAP13-1基因的定点敲除。
角蛋白关联蛋白(keratin-associated protein ，KAP)是角蛋白的重要组成成分，对毛发等皮肤衍生物的形成和结构有着重要影响。研究发现KAP13-1的调控基因角蛋白关联蛋白基因(keratin-associated protein，KRTAP)13-1参与了毛囊的早期发育，并对绒毛纤维直径产生影响。本实验利用CRISPR/Cas9系统制备KRTAP13-1基因敲除绒山羊，探究KRTAP13-1基因对于毛囊发育和纤维直径的影响，为培育超细绒型绒山羊育种新材料提供理论依据和研究基础。
1、载体构建
在KRTAP13-1基因的编码序列(Coding sequence，CDS)区域内设计了4对gRNA，并构建了Cas9/gRNA共表达载体。经Surveyor酶切检测和位点分析，选用3号Cas9/gRNA共表达载体完成本次实验。
2、单克隆细胞系的筛选
本次实验分别利用流式细胞仪分选法和口吸管分选法，将转染48h后的绒山羊胎儿成纤维细胞分选到96孔板中进行单细胞系培养。共获得100株单克隆细胞系，其中17株实现KRTAP13-1单等位基因敲除，敲除效率为17%；3株实现KRTAP13-1双等位基因敲除，敲除效率为3%。
3、KRTAP13-1基因定点敲除绒山羊的制备
本次实验从屠宰场采集卵巢979个，利用机械切割的方法共得到卵母细胞5542个，经过体外培养后获得成熟卵母细胞2971个，成熟率为53.6%。成熟的卵母细胞利用KRTAP13-1敲除细胞系进行克隆，经电融合后形成重构胚1928枚，其中卵裂的重构胚为1154枚，卵裂率为59.8%。将重构胚通过胚胎移植移入170只受体母羊的输卵管中，妊娠后得到7只羊羔，经鉴定其中3只羊羔实现了KRTAP13-1基因的定点敲除。