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自交不亲和性（Self-Incompatibility,SI）是植物抑制自交、促进异交的保守机制,也是保证植物遗传多样性的重要驱动力。基于S-RNase的配子体型自交不亲和（S-RNase-based Gametophytic Self-Incompatibility）植物占已知 SI 物种的一半以上,是植物SI中一种重要的类型。梨属于典型的配子体型自交不亲和性物种,通过花柱分泌的S-RNase,作为一种细胞毒素,抑制不亲和花粉管生长从而完成SI反应,防止梨的近亲繁殖。研究表明,梨SI极其复杂,除了 S-RNase之外,还有多个非S因子参与其反应。本研究围绕探明非S因子在梨SI反应中的功能机制开展相关研究,取得如下主要进展:1.明确了 PbrS-RNase与微丝蛋白（PbrActin1）的互作位点。首先,体外原核表达、纯化 PbrS7-RNase 和 PbrS34-RNase 蛋白及其点突变蛋白 PbrS7-RNase（116H/116R,149L/149A,1541/154A,156P/156A）和PbrS34-RNase（116H/116R,149L/149A,1541/154A,156P/156A）。已有研究表明,S-RNase降解花粉rRNA依赖于其1 16位点的组氨酸活性。为了验证S-RNase解聚微丝骨架是否需要其核酸酶活性,本研究将1 16位点的组氨酸突变为精氨酸,发现H116R突变的PbrS-RNase依然具有切割微丝骨架的功能,因此认为PbrS-RNase与PbrAct 1的互作及其解聚微丝骨架的活性不依赖于PbrS-RNase的核酸酶活性。另一方面,P156A突变的S-RNase依然具有核酸酶活性。这些结果说明S-RNase发挥其核酸酶活性和解聚微丝骨架可能是2个独立的反应过程。因此,本研究提出S-RNase通过位于其特异保守区RC4第156位点的脯氨酸与PbrActin1直接互作后,将花粉管的微丝骨架从丝状结构解聚成点状结构。2.以PbrS7-RNase作为诱饵,从花粉cDNA文库中筛选得到一个类防御素（DEFL）基因。本研究在梨花粉中发现了 23个DEFLs,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术和转录组数据分析梨DEFL成员在花粉不同发育阶段的表达模式。结果表明,超过60%的PbrDEFLs在‘砀山酥梨’和‘黄花’两个梨品种不同发育阶段的花粉中的表达量都呈现先升高后下降的趋势。并通过亚细胞定位技术分析PbrDEFL38与PbrDEFL15在细胞中的分布情况,证实了 PbrDEFL38-GFP和PbrDEFL15-GFP是一种分泌蛋白。进一步分析PbrDEFL38与PbrDEFL15在体外大肠杆菌原核表达纯化过程中所需的最佳条件,发现在15℃,IPTG终浓度为0.5 mM时,PbrDEFL38和PbrDEFL15蛋白表达量最高。通过以上分析,为PbrDEFLs在花粉中功能研究奠定了基础。3.以PbrS7-RNase作为诱饵,从花柱cDNA文库中筛选得到一个类甜蛋白（TLP）基因,并通过酵母双杂和荧光素酶互补试验进一步证实了两者的互作。运用生物信息学方法,对PbrTLPs进行梨全基因组鉴定、系统进化关系、基因结构、染色体定位和进化关系等分析,并通过qRT-PCR技术分析PbrTLPs在梨各组织中的表达模式。结果表明,梨中包含40个TLPs（PbrTLP1-PbTLP40）,被分为9个亚家族,PbrTLPs在12条染色体上呈不均匀分布,主要通过全基因复制事件（WGD）进行扩张,并在进化过程中主要受纯化选择作用。通过qRT-PCR试验表明PbrTLPs在梨各组织中均有表达。多数PbrTLPs亚细胞定位预测为分泌蛋白,并通过PbrTLP18-GFP在烟草细胞中表达得到证实。本研究表明PbrTLP基因家族成员高度保守,其不仅在植物对抗胁迫过程中发挥重要作用,还可能参与了植物自交不亲和反应。