梨MTP蛋白家族Mn-CDF亚家族的生物信息学及功能分析

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梨树是世界各地广泛种植的重要经济作物。然而,环境污染、矿质元素缺乏以及重金属毒害等导致了树木活力降低,果实产量和品质下降,已成为影响梨质量和产量的重要因素。锰(Mn)是植物代谢和发育所必需的微量元素,但过量又会使植物中毒影响其生长。植物金属耐受蛋白(MTP)在对抗锰胁迫和保持植物体内重金属的平衡方面发挥着重要作用。作为MTP家族的重要组成部分,Mn-CDF亚家族在提高植物对锰毒害的耐受能力上发挥着重要作用。然而,梨的Mn-CDF亚家族的系统分析尚未有报道。梨基因组(砀山酥梨)于2012年测序成功,本研究以此为基础,在梨基因组内对Mn-CDF亚家族基因进行了较为全面的生物信息学分析。通过酵母功能互补实验对梨Mn-CDF基因功能进行了初步探究。此外,对已验证耐高锰毒害的Mn-CDF基因对梨树幼苗不同组织中的表达进行了转录水平的分析。本研究主要结果如下:(1)首先在Pfam31.0中搜索Mn-CDF蛋白的两个保守结构域(Cationefflux和ZTdimer)的多序列比对信息,分别建立隐马尔科夫模型(HMM)。然后,以这两个HMM模型为参照,采用HMMER 3.1工具在梨蛋白数据库中进行本地化检索,共发现11个同时符合上述两个条件的待选蛋白。再结合Mn-CDF蛋白包含的特征序列D***D(*代表任意氨基酸),去除掉相同的蛋白序列和不含有特征序列的蛋白,最终在梨基因组中共鉴定出了 7个Mn-CDF蛋白。根据与拟南芥和水稻Mn-CDF蛋白序列的相似性和命名方式,将梨Mn-CDF基因依次命名为:PbMTP8.1、PbMTP8.2 PbMTP9、PbMTP10、PbMTP11.1、PbMTP11.2、PbMTP11.3。(2)通过对梨Mn-CDF蛋白序列分析,发现该亚家族基因编码的蛋白序列长度在394-416个氨基酸之间,这些蛋白均含有6个跨膜结构域(TMD),被预测定位在植物细胞内膜系统如液泡膜或高尔基体膜上。通过对这些蛋白序列进行分析,发现保守的特征序列D***D(*代表任意氨基酸)在它们的第2个和第5个跨膜区。通过将梨的蛋白序列与拟南芥的相应蛋白序列进行两两比对,结果表明61%-85%的序列一致性和72%-91%的序列相似性。利用MEGA 7.0对拟南芥、水稻和梨的Mn-CDF蛋白序列进行多序列比对并以邻接法建立进化树。根据植物中Mn-CDF的分类规则和进化树的分支,将梨的Mn-CDF成员分为2个组,其中PbMTP8.1和PbMTP8.2归为Group8;PbMTP9、PbMTP10、PbMTP11.1、PbMTP11.2、PbMTP11.3 归为 Group9。基因结构分析表明Group8中的基因含有7个外显子,而Group9中的基因含有6个外显子。保守基序分析显示这些蛋白序列中都含有6个保守基序,并且保守基序在蛋白序列上的分布相似。以上的生物信息学分析充分说明了植物Mn-CDF基因在进化上的高度保守性。(3)染色体定位分析表明,除了 PbMTP11.2和PbMTP11.3分布在未装配的Scaffold 467.0上之外,梨Mn-CDF基因均匀分布在不同染色体上。梨Mn-CDF蛋白的三维结构模型的构建和分析,表明Mn-CDF蛋白的三维模型结构相似,并且预测的三维模型是可靠的。(4)通过对梨Mn-CDF基因进行克隆、构建梨Mn-CDF基因与酵母表达载体pFL61的重组载体,然后分别转入到7种不同的酵母突变株中,结果证明除了PbMTP11.3外,其他基因编码的蛋白都能提高酵母突变株⊿pmr1对高浓度锰胁迫的耐受能力。同时,除了PbMTP11(PbMTP11.1、PbMTP11.2、PbMTP11.3)外,其他基因都能提高酵母突变株⊿ccc1对高浓度亚铁离子胁迫的耐受能力。然而,所有基因都不能提高其他酵母突变株对高浓度的锌、镉、铜、钴、镍等二价金属离子的抗性。(5)为了研究这些基因在梨苗不同组织的表达情况,我们利用荧光定量PCR的方法分别对它们在梨树幼苗中的表达进行了转录水平的分析。荧光定量PCR分析表明,不同的梨转锰基因在根、茎、叶组织中具有不同的表达模式。以上结果揭示了 Mn-CDF亚家族在维持梨树体内的Mn2+平衡及分配方面发挥的重要作用,为以后的深入研究打下基础。
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