【摘 要】
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我室多年的研究工作表明,植物细胞外CaM普遍存在,且具有多种生物学功能,并提出了细胞外CaM可能作为多功能肽类信号,通过质膜上受体介导的信号转导过程,参与多种生物学功能的工作模式。因此对于质膜上细胞外钙调素相互作用蛋白的研究有助于丰富这一假说。本实验借助生物信息学软件,分析寻找拟南芥编码蛋白同时具有分泌信号肽,跨膜域及推测的细胞外CaM结合域的基因,筛选出备选蛋白类受体激酶ERECTA,研究体内外
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我室多年的研究工作表明,植物细胞外CaM普遍存在,且具有多种生物学功能,并提出了细胞外CaM可能作为多功能肽类信号,通过质膜上受体介导的信号转导过程,参与多种生物学功能的工作模式。因此对于质膜上细胞外钙调素相互作用蛋白的研究有助于丰富这一假说。本实验借助生物信息学软件,分析寻找拟南芥编码蛋白同时具有分泌信号肽,跨膜域及推测的细胞外CaM结合域的基因,筛选出备选蛋白类受体激酶ERECTA,研究体内外条件下其与CaM的结合特性。首先,借助基因枪瞬时表达系统观察发现ERECTA基因主要定位在细胞膜上,利用钙调素特异性抗体通过免疫组化表明钙调素主要分布于茎顶端等分裂增殖、生长活跃的部位,而已有文献报道ERECTA在该部位也有明显的白表达,这说明胞外钙调素与ERECTA在组织分布上存在共定位的可能。随后,通过酵母双杂交泛素系统和表面等离子共振传感芯片分析表明,拟南芥CaM2可与ERECTA的胞外域相互作用,且结合域与网上软件预测一致。本实验还制备了CaM2与ER双重突变体,胞外钙调素超表达株系与ER突变体杂交纯合体,并鉴定了胞外钙调素超表达株系,用于进行表型观察,为进一步研究胞外钙调素在拟南芥中是否通过与ERECTA基因相互作用来共同调节植物生长发育等功能提供遗传学证据。另外,我室克隆到在拟南芥叶和花发育中具有多效性的新基因lfr-1,为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,将已经构建的融合蛋白重组表达质粒转化到工程菌中诱导表达菌体蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明融合重组蛋白成功获得了高效表达.重组蛋白经谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白亲和层析法纯化,和SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到纯度较高的抗原.经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清.采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化,结果得到只识别LFR重组蛋白的抗血清.进一步提取野生型拟南芥蛋白和lfr突变体蛋白,经蛋白质印迹检测,结果显示在野生型拟南芥蛋白分子量50kDa左右处出现特异的蛋白质条带而在lfr突变体蛋白中未出现,证明所制备的抗血清可以与拟南芥LFR蛋白特异性结合.
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