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透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种重要的粘多糖，改良菌种和选育能产生高分子量HA的高产菌株是发酵法生产工艺的基础。 本文研究代谢工程理论，对本实验室的一株HA生产菌(Streptococcusequi)进行了HA合成与分解关键酶基因及功能的研究。在分析了HA生物合成与分解代谢途径的基础上设计实验，通过基因敲除减少出发菌的透明质酸分解酶(Hyl)对HA的降解。目前在国内文献中未见其他学者报道类似工作。 以S．equi的总DNA为模板，通过PCR方法，克隆、测序了透明质酸合成酶(HAS)基因hasA片段，构建了hasA的表达质粒pSE380-HAS。经转化大肠杆菌DH5a和IPTG诱导表达，提取原生质膜在体外利用活性前驱物合成了透明质酸。 以S．equi的总DNA为模板，通过PCR方法，克隆了透明质酸分解酶基因(hyl)，测序后连接到表达载体pSE380的trc启动子下游，构建表达质粒pSE380-hyl。经转化大肠杆菌DH5a和IPTG诱导表达后用SDS-PAGE电泳分析，获得一条约120KDa的表达条带；IPTG诱导表达后提取原生质膜测定透明质酸分解酶活力，表明该hyl片段的产物能够在体外分解细菌来源的HA。 采用两种策略灭活hyl基因。(1)直接插入外源基因灭活hyl方法：将hyl片段与载体pUC19／pBR322连接后，用来自pUC19的Amp~r抗性基因片段从hyl基因的中部插入将载体上的hyl片段分为两部分；(2)用hasA替换hyl部分片段的方法：将hyl片段与载体pUCl9／pBR322连接后，用hasA片段替换部分hyl，再将Amp~r片段接入到hasA上游。分别用4种改造质粒转化S．equi。用Amp~r抗性初选，测定转化子的透明质酸分解酶(Hyl)活力，筛选Hyl酶活力下降或丧失的转化子。 在无法获得更好载体的惰况下，经过多次转化筛选，获得数株透明质酸分 解酌活性比出发函株低的转化子，供下一步羹因陵除验证和其他研究使用。