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研究目的:临床设计两种剂量地西他滨用于AML或MDS患者,观察疗效、不良反应、血象恢复和生存时间等指标,寻找个体化剂量方案;实验室设计地西他滨不同浓度和作用时间,对白血病细胞系K562和正常外周血单个核细胞作用进行研究,以探讨地西他滨对白血病细胞的作用机制。1.材料与方法1.1 2010年5月至2015年12月陕西省人民医院血液科收治的应用地西他滨的AML和MDS患者共61例。地西他滨按应用剂量分为AB两组,对两组病例年龄、性别、危险度分级、化疗1-2疗程后缓解率、化疗后骨髓抑制、感染、出血、肝肾损害、外周血象恢复时间、生存时间等指标进行统计分析。1.2地西他滨受赠于山东新时代医药公司,白血病细胞系K562由陕西省人民医院血液内科实验室传代培养。倒置显微镜观察地西他滨同一浓度(100μmol/L)作用于K562细胞不同时间(24h、48h、72h)细胞形态;台盼蓝拒染法检测地西他滨不同药物浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)、不同作用时间(24h、48h、72h)细胞存活率;流式细胞术检测地西他滨不同药物浓度、不同作用时间(24h、48h)细胞早期及中晚期凋亡率;实时荧光定量PCR法检测一定时间范围内不同浓度地西他滨对K562细胞BCR/ABL融合基因P210表达的影响。收集3份正常人外周血,分离单采后经Ficoll密度梯度离心法分离提取获得单个核细胞,地西他滨工作浓度100μmol/L,作用于正常单个核细胞72h,台盼蓝拒染法检测加药组与对照组单个核细胞增殖情况;利用蛋白质印迹法(Western-Blot)检测不同浓度地西他滨对Caspase-3活性的影响。2.实验结果2.1临床结果(1)20 mg/㎡/d1-d5剂量组疗效优于15 mg/㎡/d1-d5剂量组(P<0.05)。(2)20 mg/㎡/d1-d5剂量组不良反应发生率(骨髓抑制、感染)较15 mg/㎡/d1-d5剂量组高(P<0.05)。(3)(1)15mg/㎡/d1-d5剂量方案:外周血白细胞计数(WBC)<4.0×109/L持续时间为10~33 d,平均18.90 d;外周血血小板计数(PLT)<50×109/L持续时间为12~35d,平均22.00 d。(2)20mg/㎡/d1-d5剂量方案:外周血白细胞计数(WBC)<4.0×109/L持续时间为12~31 d,平均18.36 d;外周血血小板计数(PLT)<50×109/L持续时间为17~41 d,平均25.96 d。(4)20mg/㎡/d1-d5方案中位生存期(11月)与15mg/㎡/d1-d5方案中位生存期(15月)相比差异无明显统计学意义(P>0.05)。2.2实验室结果(1)倒置显微镜下观察地西他滨作用白血病K562细胞不同时间后细胞的形态变化:相同浓度地西他滨(100μmol/L)作用于K562细胞24h后,细胞形态完整;作用48h后可见少数细胞发生肿胀,甚至变形,偶有凋亡小体的出现;作用72h后细胞数较前减少,形态更加不规则,出现较多凋亡小体及细胞碎片,部分细胞出现空泡变形等。(2)台盼蓝拒染实验检测地西他滨对白血病K562细胞的增殖抑制:不同浓度的地西他滨(50μmol/L、100μmol/L)在24h、48h、72h均能抑制K562细胞的增殖,且其抑制作用呈浓度及时间依赖性;(3)Annexin V-7AAD双标法流式细胞术检测地西他滨对白血病K562细胞的凋亡影响:比较不同浓度地西他滨处理细胞相同时间后测得的各组细胞凋亡率:实验组(50μmol/L、100μmol/L)与对照组凋亡率相比、作用48h后实验组(50μmol/L、100μmol/L)间差异均有统计学上的显著性意义(P<0.05),而作用24h后实验组(50μmol/L、100μmol/L)间凋亡率相比差异无统计学上的显著性意义(P>0.05);比较不同时间同一浓度地西他滨处理细胞后各组细胞凋亡率:实验组(50μmol/L、100μmol/L)分别比较24h和48h后K562细胞凋亡率,其差异均有统计学上的显著性意义(P<0.05);(4)实时荧光定量PCR检测K562细胞BCR/ABL融合基因P210的表达:不同浓度(50μmol/L、100μmol/L)地西他滨作用于K562细胞72h后收集细胞进行实时定量PCR检测,其结果显示地西他滨可下调K562细胞BCR/ABL融合基因P210的表达(P<0.05),且随着地西他滨作用浓度的增大,其下调作用逐渐增强;(5)台盼蓝拒染法测定地西他滨对正常单个核细胞的影响作用:同一浓度地西他滨(100μmol/L)作用于正常单个核细胞不同时间(24h、48h、72h)后利用台盼蓝拒染法进行活细胞计数,发现地西他滨对正常单个核细胞的增殖无明显影响(P>0.05);(6)Western-blot法测地西他滨对Caspase-3活性的影响:对照组Cleaved Caspase-3表达不明显,实验组的Cleaved Caspase-3表达水平均明显高于对照组;地西他滨(100μmol/L)组的Cleaved Caspase-3表达水平明显高于地西他滨(50μmol/L)组。3.研究结论在中位生存期无差别的情况下,地西他滨20 mg/㎡/d1-d5方案较15 mg/㎡/d1-d5方案疗效好,但地西他滨20 mg/㎡/d1-d5方案的骨髓抑制、感染发生率均较15 mg/㎡/d1-d5方案高;在地西他滨对正常单个核细胞增殖无明显影响的浓度下,对白血病K562细胞的生长增殖有明显抑制作用,其抑制强度呈浓度及时间依赖性;地西他滨对K562细胞BCR/ABL融合基因P210的表达具有明显下调作用,且可显著上调Caspase-3活性。