目的:1.研究TFF3在NASH中对肝脏炎症、凋亡、组织修复的作用及相关调控信号通路。2.基于TFF3的作用,探讨降脂颗粒改善高脂饮食诱导的NASH小鼠肝损伤的作用机制。方法:1.体外研究TFF3在NASH中的作用及其信号通路:通过慢病毒转染,构建TFF3过表达的人肝细胞Hep G2、Huh7,检测内源性TFF3对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的细胞损伤、凋亡、炎症因子表达的干预作用,及对细胞增殖促进修复能力的影响。用重组人TFF3(recombinant human trefoil factor 3,rh TFF3)干预PA诱导的Hep G2、Huh7及小鼠正常肝细胞AML12,检测外源性TFF3对抗损伤、炎症反应和促修复的作用。并应用Western blot检测EGFR/AKT的活化水平来探讨TFF3作用信号通路。另外,用rh TFF3干预PA和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的巨噬细胞RAW264.7,研究TFF3对巨噬细胞炎症反应的调控作用。2.体内研究TFF3在NASH中的作用及降脂颗粒的干预机制:用高脂饲料诱导雄性C57BL/6小鼠以建立NASH模型,对照小鼠给予普通饲料饲养。动态观察肝组织病理及肝脏TFF3的表达变化。自第18w药物组同时予降脂颗粒干预,于22w结束实验。检测各组小鼠血清转氨酶水平及观察肝脏组织病理改变。并通过RT-PCR和Western Blot检测肝组织TFF3水平,以及凋亡和炎症相关基因的表达水平。结果:1.体外研究TFF3在NASH中的作用及其信号通路:PA诱导24h后,与对照细胞比较,TFF3过表达的Hep G2、Huh7生物学行为有所改变:细胞活力较高;TUNEL染色阳性细胞较少,cleaved-PARP、Bim蛋白表达水平明显下降,而抗凋亡的p-Bcl-2蛋白水平上调;细胞表达炎症因子IL-1β、IL-6显著降低。另外,TFF3过表达细胞的增殖能力显著增加。PA诱导24h,同时给予1μg/ml的rh TFF3干预的Hep G2、Huh7及AML12细胞的活力较高,cleaved-PARP、Bim蛋白水平下调,p-Bcl-2表达上调,p-EGFR、p-AKT表达上调;p-NF-κB及IL-1β、IL-6显著降低。细胞的增殖能力在rh TFF3作用下也显著增加。PA诱导24h或LPS 100ng/ml诱导1h,同时给予1μg/ml的rh TFF3干预的RAW264.7细胞,p-NF-κB及IL-1β、IL-6表达水平显著降低。2.体内研究TFF3在NASH中的作用及降脂颗粒的干预机制:高脂喂养8w、12w、16w、22w时,小鼠肝组织中肝细胞脂肪变性程度逐渐加重,自16w出现局灶性炎性细胞浸润,22w出现肝细胞气球样变,形成NASH模型。小鼠肝组织TFF3 mRNA在第8、12w表达较对照组高,16w后呈下降趋势,22w模型组显著低于对照组。比较第22w对照组和模型组小鼠,模型组血清ALT升高,肝组织TFF3 mRNA、蛋白表达均较对照组降低,促凋亡分子cleaved Caspase-3、Bim蛋白表达显著升高,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高,p-NF-κB蛋白表达升高,p-EGFR、p-AKT蛋白表达下降。相对于模型组,降脂颗粒组小鼠血清ALT明显降低,肝脏脂肪变性明显减轻、炎性浸润和气球样变减少,肝组织TFF3 mRNA、蛋白表达显著升高,cleaved Caspase-3、Bim蛋白表达降低,IL-1β、TNF-α水平显著下调,p-NF-κB蛋白表达显著下调,p-EGFR、p-AKT蛋白表达上调。结论:1.TFF3具有减轻脂肪酸及内毒素诱导的NASH肝损伤的作用,其作用可能通过促进EGFR/AKT活化减轻肝脏凋亡、促进组织修复,通过抑制NF-κB活化来抑制炎症反应。2.降脂颗粒能够上调NASH小鼠肝组织TFF3表达,促进EGFR/AKT活化,抑制NF-κB活化,减轻肝脏炎症损伤、细胞凋亡,是其改善NASH小鼠肝损伤的部分作用机制。