目的和意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是主要发生在我国南方居民、土著格陵兰人及阿拉斯加因纽特人的一种恶性肿瘤。据估计,人类所有癌症的15-20%归因于病毒感染。鼻咽癌发病与爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus,EBV)感染密切相关,在鼻咽癌中,EB病毒主要是处于膜潜伏Ⅱ性感染状态,病毒的基因只能限制性地表达,病毒编码表达的产物限于EB病毒核抗原1(EBV-determined nuclear antigen 1,EBNA1)、EB 病毒编研码的小 RNA(EBV encoded small RNA,EBER)、潜伏膜蛋白 1(latent membrane protein 1,LMP1)、潜伏膜蛋白 2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)和 BamHI A 区右向框 0(BamHI A rightward fram 0,BARFO)等。LMP1是EB病毒潜伏感染的标志性产物,其能在软琼脂上转化啮齿类动物细胞使得细胞获得生长的能力。到目前为止,至少有3条明确的信号通路能够被LMP1羧基末端结构域所激活,它们分别是:NF-κB信号通路、p38/MAPK信号通路以及JNK信号通路。PTEN 基因(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10)全称是与张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶基因。作为一个已公认的关键抑癌基因,PTEN基因重要功能之一就是通过其脂质磷酸酶活性调节PI3K/AKT信号通路。PTEN能够广泛地调控细胞和生理水平中的各种重要活动,比如代谢和染色体稳定性等。最近PTEN通过与组蛋白和染色质的相互作用调节基因转录的功能也得到了验证。在许多癌症中PTEN的功能缺失能够导致细胞存活、增殖和生长。在鼻咽癌的发病过程中,抑癌基因如p53通过缺失、插入或者突变而失活并不常见,随着在分子生物学水平对肿瘤的深入研究,人们发现表观遗传学调控在鼻咽癌的发生发展中起着重要的作用,抑癌基因启动子的甲基化是其失活的主要原因之一。值得注意的是,在多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和EB病毒阳性的胃癌等,PTEN基因启动子区异常的高甲基化是导致PTEN表达缺失的重要机制之一,但迄今未见鼻咽癌中PTEN基因甲基化状态方面的报道。目前,已有研究报道EB病毒感染能调控宿主抑癌基因CpG岛甲基化。在鼻咽癌中LMP1通过活化c-Jun氨基末端激酶激活蛋白-1信号通路从而激活甲基化转移酶 1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)使得 E-cadherin 启动子区发生异常的高甲基化从而导致其表达下调,LMP1也能通过上调DNMT1、DNMT3a和DNMT3b使得RARB启动子区域发生异常的高甲基化,从而导致其表达下调,LMP1还能通过E2F1/pRB/DNMT1信号通路沉默抑癌基因DOK1。因此,LMP1是否在鼻咽癌中能通过调控PTEN基因启动子CpG岛异常甲基化状态抑制PTEN进而激活其下游信号通路(如PI3K/Akt信号通路)值得我们深入研究。本研究的主要目的是阐明EB病毒通过病毒编码的LMP1促进宿主抑癌基因PTEN CpG岛发生异常高甲基化从而导致PTEN失活的分子机制。我们首先通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了鼻咽癌标本和对照标本中PTEN mRNA的表达,使用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和测序的方法检测了 PTEN CpG岛甲基化状态,对三株鼻咽癌细胞株HONE1、CNE1和6-10B行去甲基化药物5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dC)处理并随后进行了 PTEN mRNA 水平的检测,初步证实PTEN CpG岛异常甲基化是PTEN失活的重要原因之一。我们进一步研究发现LMP1和DNMT3b(DNAmethyltransferase 3b,甲基化转移酶3b)的表达与PTEN CpG岛异常高甲基化状态密切相关,并通过实验证实LMP1能够激活转录因子NF-κB,后者能直接绑定到DNMT3b启动子区域从而上调DNMT3b的表达,最终导致PTEN CpG岛发生异常的高甲基化。因此,本研究初步证实EB病毒通过LMP1/NF-KB/DNMT3b这一信号通路导致PTEN CpG岛异常高甲基化是鼻咽癌中PTEN失活的重要原因之一,这将为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定了理论基础。材料和方法1.细胞培养本实验所用的的人鼻咽癌细胞株5-8F、6-1 0B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和SUNE1来自南方医科大学肿瘤研究所,细胞培养采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株HONE1和C666-1由香港大学的George S.W.Tsao教授惠赠。细胞在37℃、5%C02和饱和湿度的条件下传代培养,生长状态良好时用于实验。2.临床标本收集50例鼻咽癌组织和22例鼻咽慢性炎组织均来源于南方医院耳鼻喉科标本库,所有标木均为鼻咽部活检组织,经病理学检查确诊,鼻咽癌组织学分型为非角化性未分化型鳞癌,所有患者均尚未接受放化疗治疗。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3.载体构建(1)LMP1过表达质粒:该质粒由中山大学肿瘤防治中心曾木圣教授惠赠。(2)DNMT3B-pGL3-WT 和 DNMT3B-pGL3-MUT 质粒:以 293T 细胞基因组DNA为模板,扩增DNMT3b启动子区域,由转录起始位点前-773bp到转录起始位点后+187bp共960bp,将该片段克隆到pGL3-control质粒,得到重组质粒DNMT3B-pGL3-WT,然后将该重组质粒进行定点突变,得到突变质粒DNMT3B-pGL3-MUT。(3)pcDNA3.1-p65质粒:真核表达质粒pcDNA3.1-p65及其对照质粒均购置于广州达恩基因科技有限公司。4.荧光定量PCR抽提细胞和组织的总RNA和小分子RNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。5.Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。6.双荧光素酶活性检测将1 × 104个293T细胞铺在24孔板上,待细胞贴壁之后共转染20ng的LMP1或者是NC质粒,5 ng的pRL-CMV海肾荧光素酶报告质粒以及30 ng的野生型DNMT3B-pGL3-WT或者是突变型的DNMT3B-pGL3-MUT荧光素酶报告基因质粒,瞬时转染48h后,将细胞裂解,然后利用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统分别测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。7.MTT实验将1×103个细胞接种于96孔板中,每孔体积200μl,每组5孔,同时设空白对照,分别培养1、2、3和4天。每孔加入5mg/ml的MTT 20μl,37℃培养4h后终止培养,小心吸弃孔内培养基,加入二甲基亚砜150μl,室温孵育10min,使结晶物充分溶解,以空白对照孔调零,酶标仪上490nm测定各孔吸光度值(OD值),以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。8.甲基化特异性PCR本实验以亚硫酸氢盐修饰的DNA为模板,使用甲基化特异性PCR来检测PTEN基因启动子特定区的甲基化状态。DNA经过Qiagen公司的EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒进行亚硫酸氢盐反应进行变性处理。MSP实验至少重复检测2次。9.甲基化敏感的高分辨率熔解曲线分析技术甲基化敏感的高分辨率熔解曲线分析技术(Methylation-sensitive high-resolution melting,MS-HRM)按照 Wojdacz 等人发表在 Nature protocols 的方法进行。MS-HRM检测的是随着温度的上升DNA双链发生熔解时嵌入DNA双链荧光染料的信号所发生的变化。MS-HRM分析使用的是美国爱达荷科技公司LightScanner系统。使用LightScanner系统提供的软件对熔解曲线进行标准化及计算。10.染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀检测是使用Millipore公司的EZ-ChIPTM染色质免疫沉淀试剂盒进行检测,所有操作都按照试剂盒的说明书进行。ChIP级别的NF-κB p65抗体购置于Abcam,所使用的IgG阴性对照抗体和上下游阴性对照GAPDH引物均来自于Millipore公司的EZ-ChIPTM染色质免疫沉淀试剂盒。11.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。MTT实验采用析计设计的方差分析;甲基化与临床资料的相关分析采用卡方检验;鼻咽癌组织中LMP1、LMP2A和DNMT3b表达水平的相关性分析采用Spearman相关系数进行统计分析;其他实验中涉及到两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,而三组或三组以上数据的比较采用单因素方差分析。p<0.05为差异有统计学意义。结果1.PTEN CpG岛异常甲基化是鼻咽癌发生发展的早期事件利用荧光定量PCR检测PTEN mRNA在45鼻咽癌标本和22个非肿痛瘤鼻咽上皮(NP)组织中的表达水平,结果显示鼻咽癌(NPC)组织PTEN mRNA的表达水平显著低于非肿瘤组织(p<0.0001)。同时通过荧光定量PCR对人类鼻咽癌细胞株的PTEN mRNA表达水平进行了分析,与非肿瘤的NP组织相比在所有5株鼻咽癌细胞株中PTEN mRNA的表达水均下调。这些数据支持PTEN mRNA在鼻咽癌中表达下调。为了探究PTEN基因CpG岛异常甲基化在其转录沉默中可能发挥的作用,我们采用MSP方法检测临床鼻咽癌标本、正常鼻咽部上皮和鼻咽癌细胞株中PTEN CpG岛甲基化状态。由于PTEN的CpG岛长约3 kb,我们挑选了 CpG岛密度较高的区域进行了 MSP检测。MSP检测结果表明鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞株中PTEN启动子区CpG岛发生甲基化的比率均为80%(40/50和4/5),而在非肿瘤组织中甲基化的发生率仅为5.3%(1/19)。鼻咽癌组织和非肿瘤组织之间PTEN启动子区CpG岛甲基化水平有统计学差异(p<0.0001)。为了验证MSP检测结果的可靠性,我们进一步挑选了两个鼻咽癌组织MSP和USP的扩增产物进行了测序。测序结果证实,除了那些在CpG岛上被甲基化的胞嘧啶之外,MSP扩增产物中所有的胞嘧啶均转化为胸腺嘧啶,表明这些CpG二核苷酸上确实存在甲基化的胞嘧啶。我们使用去甲基化药物5-aza-dC对3株鼻咽癌细胞株(HONE-1,CNE1和6-10B)进行了处理,然后检测PTEN mRNA表达的变化来检测PTEN启动子区CpG岛甲基化与其表达下调之间的相关性,经5-aza-dC处理后3株鼻咽癌细胞株中,PTEN rmRNA表达均明显地上调。这些结果表明,在鼻咽癌中PTEN启动子区CpG岛异常甲基化是其表达下调的重要原因之一。2.EB病毒感染的细胞株和鼻咽癌组织的PTEN CpG岛发生了异常的高甲基化我们首先比较了 PTEN在EBV阳性和EBV阴性的鼻咽癌细胞株中的表达水平。在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C666和HONE1中,PTEN基因的mRNA以及蛋白质表达均下调。为了探究PTEN在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株中表达下调的可能机制,我们使用MSP方法检测EBV阳性和EBV阴性的鼻咽癌细胞株中PTEN启动子区CpG岛甲基化状态,结果表明在EBV阳性和EBV阴性NPC细胞株中PTEN启动子区CpG岛均发生了甲基化。我们采用甲基化敏感的高分辨率熔解曲线分析技术(MS-HRM)检测EBV阳性和EBV阴性NPC细胞株中PTEN启动子区CpG岛甲基化程度的差异,非常有趣地发现在EBV阳性的NPC细胞株中其熔链温度明显要比EBV阴性的NPC细胞株增高,提示在EBV阳性的NPC细胞株中PTEN启动子区CpG岛甲基化程度要明显高于EBV阴性NPC细胞株。为了进一步验证MS-HRM检测结果的可靠性,我们将跑MS-HRM所用的PCR扩增产物挑克隆进行测序,测序结果发现在PCR扩增产物中,EBV阳性的NPC细胞株中发生甲基化的CpG岛的数目要明显多于EBV阴性(p<0.01)。我们通过荧光定量PCR检测分析了这50例鼻咽癌组织标本和另外22例非肿瘤鼻咽上皮组织标本中LMP2A、LMP1和EBNA1 mRNA的表达水平,发现LMP2A、LMP1以及EBNA1在鼻咽癌组织中的表达明显高于正常组织(p<0.001)。同时,我们进一步在50例鼻咽癌标本上分别进行PTEN启动子区CpG岛甲基化程度和EB病毒Ⅱ型潜伏感染相关基因的表达水平分析。根据50例鼻咽癌组织标本的MSP检测结果,我们首先将鼻咽癌组织标本分为甲基化组和无甲基化组,并对其中发生甲基化的40例鼻咽癌组织进行MS-HRM检测。MS-HRM结果可以将这40例鼻咽癌组织分为高甲基化组和低甲基化组。然后,我们比较了 NPC组织PTEN CpG岛甲基化组和无甲基化组中EBNA1、LMP2A和LMP1 mRNA的表达差异情况,结果发现两组之间EBNA1、LMP2A和LMP1 mRNA的表达水平均无统计学差异(p>0.05)。我们又比较分析了 NPC组织PTEN CpG岛高甲基化组和低甲基化组的EBNA1、LMP2A和LMP1的表达情况,发现LMP2A和LMP1 mRNA在高甲基化组的表达水平要明显高于低甲基化组(^=0.0183;p=0.0371)。DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b是调控细胞甲基化状态的主要蛋白。为了检测EBV介导的PTEN CpG岛异常高甲基化状态是否是通过DNA甲基转移酶起作用,我们同时检测了上述50例NPC组织标本的DNA甲基转移酶mRNA的表达水平,比较了 NPC组织PTEN CpG岛甲基化组和无甲基化组中DNA甲基转移酶mRNA的表达差异,然而,在两组之间DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA的表达水平均无统计学差异(p>0.05)。我们又比较了 NPC组织PTEN CpG岛高甲基化组和低甲基化组中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA的表达差异,有趣地发现DNMT3b在高甲基化组的表达水平要明显高于低甲基化组(p=0.0012)。该实验结果提示,如果PTEN CpG岛高/低甲基化状态确实是受到LMP1和LMP2A的调控,LMP1和LMP2A则有可能是通过上调甲基化转移酶3b表达和增强其活性从而使得PTEN CpG岛发生异常的高甲基化。3.鼻咽癌中EB病毒LMP1通过NF-κB信号通路活化DNMT3b沉默抑癌基因PTEN在上述研究的基础上,我们进行了同一鼻咽癌标本中LMP1和LMP2A与DNMT3b在mRNA水平表达的相关性分析,结果表明DNMT3b mRNA与LMP1A mRNA的表达存在明显的相关性(r =0.365;p 0.05),DNMT3b mRNA与LMP2A mRNA的表达存也在明显的相关性(r = 0.431;p<0.01)。我们通过荧光定量PCR在瞬转LMP1的EB病毒阴性鼻咽癌细胞株C666和HONE1中检测到了 DNMT3b mRNA表达水平的上调。在鼻咽癌细胞株C666转染LMP1质粒12小时之后DNMT3b mRNA上调了 4.05倍,24小时时上调了 4.2倍,这一上调状态一直持续到转染48小时之后。在鼻咽癌细胞株HONE1转染LMP1质粒后也出现了类似的DNMT3br mRNA表达水平上调的过程。通过MS-HRM检测,我们发现在鼻咽癌细胞株C666及HONE1转染LMP1质粒后PTEN CpG甲基化程度上调,这提示LMP1在调控PTEN CpG岛异常高甲基化过程中发挥着重要的作用。在EB病毒感染的鼻咽癌中,LMP1羧基末端结构域能够激活多条信号通路,如NF-κB、p38/MAPK和JNK。本课题对Eric Hervouet等报道的转录因子芯片的结果进行分析,以及对UCSC网站上ENCODE(Encyclopedia of DNA Elements)数据库进行检索,发现NF-κB能够特异性地启动DNMT3b的转录。后续的生物信息学预测进一步发现,在DNMT3b的启动子区域转录起始位点上游(-159,-150)区域存在着转录因子NF-κB的结合位点,而且这一结合位点在各个物种之间高度保守。我们构建了含有野生型或者突变型NF-κB结合位点的DNMT3b启动子区荧光素酶报告基因系统,并共转染LMP1或对照质粒,48小时后检测荧光强度,发现含野生型NF-κB结合位点组荧光强度明显高于突变型,差异具有统计学意义,这说明NF-κB能够活化DNMT3b的转录。ChIP结果证实NF-κB活化DNMT3b的方式是直接绑定到其启动子启动其转录。WB和免疫荧光的结果也支持LMP1介导的DNMT3b表达上调及转位入核依赖于NF-κB信号通路。这些研究结果表明:LMP1能活化NF-κB,促进其结合到DNMT3b的启动子区域,从而增强DNMT3的转录调控过程。结论1.在鼻咽癌中PTEN CpG岛发生了异常的甲基化;2.在EB病毒感染的鼻咽癌组织和细胞株中PTEN CpG岛发生了异常的高甲基化;3.EB病毒LMP1通过NF-κB信号通路活化DNMT3b从而上调抑癌基因PTEN的甲基化水平。