论文部分内容阅读
目的:非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是代谢综合征（metabolic syndrome,MS）在肝脏的病理学表现,它的病理变化可从初始的单纯性脂肪变性演变成为非酒精性脂肪肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）、肝纤维化甚至是肝癌。这些病理过程不仅包括过度的脂质沉积对肝细胞造成的脂肪毒性损伤,还包括大量免疫细胞聚集和活化造成的肝脏炎性损伤。近年来,越来越多的研究发现血小板在肝脏疾病与稳态中的重要作用,特别是,抗血小板治疗可以减少非酒精性脂肪肝组织中的血小板聚集并改善脂肪肝的炎性病变。前期的研究已经发现了血清淀粉样蛋白A1（serum amyloid A protein 1,SAA1）是一种与高脂饮食诱导的肥胖密切相关的基因,且SAA1能促进肝脏胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）,而肥胖者常伴随IR、血脂异常和NAFLD的发生。在本研究中,我们在明确了脂肪肝组织中高表达SAA1和大量血小板聚集的基础上,将进一步阐明SAA1介导的Toll样受体2（Toll like receptor2,TLR2）信号对血小板聚集和活化的影响,并探索脂肪变性诱导的SAA1是否通过促进血小板聚集来加剧NAFLD的肝脏炎性病变。方法:1.采用高脂饲料喂养16周来建立NAFLD小鼠模型,通过HE染色,观察肝脏病理变化,通过Western blot和Real time-PCR方法检测SAA1在正常鼠与NAFLD鼠来源的肝组织中的表达。2.用油酸诱导肝细胞发生脂肪变性,Western blot和Real time-PCR方法检测SAA1的表达。3.正常肝组织与NAFLD肝组织经免疫组化染色检测CD42b的表达,明确血小板在肝组织的聚集情况。4.血小板用重组的SAA1蛋白孵育5分钟或者不做处理,再用二磷酸腺苷（Adenonisine disphosphate ADP）（2.5μM或5μM）、凝血酶（Thrombin）（0.04U/m L或0.08U/ml）和胶原（Collagen）（1μg/ml或2μg/ml）刺激后,经聚集仪检测血小板聚集水平,Western blot法检测P-Akt473、Akt、P-GSK-3β、GSK-3β、P-P38、P-Syk和Syk的表达。5.血小板经SAA1或替罗非班（Tirofiban）刺激后在预先包被胶原的载玻片上孵育,未刺激的血小板分别在牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）包被的载玻片和纤维蛋白原包被的载玻片上孵育,45分钟后,经鬼笔环肽（TRITC-Phalloidin）染色,观察血小板的粘附。6.L-02肝细胞被转染Lv-EGFP和Lv-sh RNA-SAA1后,进一步经油酸刺激培养,收集条件培养基（conditioned medium,CM）,用其孵育血小板1 h,经Thrombin刺激后,用聚集仪检测血小板聚集水平,流式检测P-选择素（P-Selectin,CD62P）表达,Western blot法检测P-Akt473、Akt、P-GSK-3β、GSK-3β、P-P38、P-Syk和Syk的表达。7.血小板经SAA1（10μg/ml）、SAA1（10μg/ml）+TLR2 Block Ab（4μg/ml）预先孵育后,再分别用ADP（2.5μM）、Thrombin（0.04U/ml）和Collagen（1μg/ml）刺激,经聚集仪检测血小板的聚集变化,Western blot法检测P-Akt473、Akt、P-GSK-3β、GSK-3β、P-P38、P-Syk和Syk的表达。8.分别收集正常鼠、尾静脉注射Lv-sh RNA-NC或者Lv-sh RNA-SAA1的高脂饮食（high fat diet,HFD）小鼠的肝组织,免疫组化检测CD42b、CD3、F4/80和Ly6g的表达,通过分离正常鼠、注射Lv-sh RNA-NC或者Lv-sh RNA-SAA1的HFD小鼠的肝非实质细胞,流式分析CD4+细胞和CD8+细胞的比例。结果:1.高脂饲料喂养16周后,NAFLD小鼠肝脏组织明显脂质沉积,SAA1表达增加。2.油酸诱导后肝细胞内形成明显的泡状脂滴,脂肪变性的肝细胞中SAA1表达增加。3.正常肝组织中,少量零散的血小板分布在肝窦中,而在NAFLD鼠的肝组织,大量血小板在肝血窦中,呈现出明显的聚集现象。4.在低浓度的血小板激动剂（ADP、Thrombin和Collagen）的刺激下,SAA1具有增强血小板聚集的作用。当在高剂量的血小板激动剂（ADP和Collagen）的刺激下,虽然SAA1也呈现出增强血小板聚集的作用,与对照组相比无统计学差异,考虑高浓度的ADP、胶原对促进血小板聚集作用过强掩盖了SAA1的作用所致。5.BSA包被的细胞爬片上只有很少的血小板黏附,未经处理的血小板在胶原包被的细胞爬片上呈现出正常粘附和扩展,孵育SAA1的血小板在包被胶原的细胞爬片上粘附数目增多,体积变大。在替罗非班（Tirofiban）孵育后,血小板在胶原包被的细胞爬片上粘附数量较少,血小板扩展的体积也较小。6.相对于未刺激的血小板来说,低浓度的Thrombin刺激可诱导血小板P-Akt473、P-GSK-3β、P-P38和P-Syk表达升高,而当SAA1与低浓度的凝血酶联合刺激时,相对于单独凝血酶刺激来说,这些分子表达又进一步升高。7.相对于转染Lv-EGFP来说,转染Lv-sh RNA-SAA1的L-02肝细胞经油酸诱导后的CM不能有效刺激血小板聚集;同样,P-Selectin和血小板活化相关分子（P-Akt473、P-GSK-3β、P-P38和P-Syk）表达也明显减弱。8.经SAA1孵育的血小板的聚集率明显增高,在用TLR2信号阻断抗体（TLR2Block Ab）和SAA1联合孵育时,血小板的聚集程度出现明显减弱;另外,TLR2信号抑制时,血小板活化相关分子（P-Akt473、P-GSK-3β、P-P38和P-Syk）的表达降低。9.体内SAA1表达抑制导致NAFLD小鼠肝内血小板聚集减少,肝组织中炎性细胞（CD3+细胞、F4/80+细胞和Ly6G+细胞）浸润也显著减少;此外,肝内非实质细胞中的CD8+细胞比例也明显减少。结论:本研究确定了高脂饮食诱导的肝脏高表达的SAA1通过TLR2信号促进血小板在肝组织聚集从而加重脂肪肝炎症病变,这些结果也表明,SAA1可能被用作改善NAFLD病变的潜在靶点。