小分子RNA（mi RNAs）是一类在转录后水平负性调控基因表达的非编码RNA。mi RNA调节失控在肿瘤的演进中有着非常重要的作用。在本研究中,miR-208-3p高表达并直接抑制了ARID2的表达。在体外实验中,mi R-208-3p表达下调及ARID2过表达抑制了HCC细胞的增生和侵袭,两者效果相近。而在体内实验中,mi R-208-3p表达下调直接抑制Hep3B细胞系的成瘤性。本研究也证明了ARID2极有可能是TGFβ1)/mi R-208-3p/ARID2调节通路的下游因子。以上结果mi R-208-3p表达上调与肝细胞肝癌演进有着密切关系,并为临床治疗肝癌提供新的治疗靶点。前言肝细胞肝癌在全世界范围是一种最广泛、死亡率较高且治疗效果也差强人意的恶性肿瘤[1-3]。目前为了寻求除药物和手术外更有效的治疗方式,人们把眼光投向了基因靶向治疗,试图从基因层次更深刻的了解并治疗此病。小分子RNA（miRNAs）是一类在转录后水平结合在mRNA互补序列上负性调控基因表达的非编码RNA[4,5]。而小分子RNA的调节失常在肿瘤的发生和演进中起了重要的作用。最常见的miR-21在多种癌症如结肠癌、前列腺癌、结直肠癌和肝癌中高表达[6-9],而miR-34a,miR-15-/16 cluster,and let-7 miRNA则在多种恶性肿瘤中呈现低表达状态[10-13]。miR-208失调可导致食道鳞癌的侵袭、转移并诱导胰腺癌的EMT,对于它的研究却很少[14,15]。ARID2来源于12q染色体,由21个外显子构成,它是polybromo-associated BRG1-associated factor（PBAF）染色质重组复合物的一个亚基,switch/sucrose non-fermenting（SWI/SNF）配体依赖性被诱导表现出ATP酶活性,在催化ATP后影响组蛋白和DNA之间交互稳定性的核受体[16]。人类ARID超级家族包含15个分子（7大类）,它们都属于SWI/SNF的亚基。人类ARID2含有一个RFX螺旋翼保守N端（脯氨酸及谷氨酸富含区）,两个含C2H2锌指模序的C端[17]。含ARID的蛋白参与多种生化过程,包括胚胎发育,细胞排列和周期调控。之前也有文献报道ARID2参与肿瘤演进过程,如在HCC中ARID2作为肿瘤抑制因子发生突变失去功能[18,19]。在非小细胞肺癌和结直肠癌中经常发现ARID2由于突变丧失其肿瘤抑制的功能[20,21]。hcv相关的hcc中已经确定的arid2的变异形式有三种:移码突变、无义突变和剪切位点突变。这些突变都提示arid2蛋白的缩短和失活。有趣的是,有些突变仅仅影响了锌指模序,但同时也意味了锌指模序对于arid2正常功能的重要性。除了遗传学证据外,功能学研究也表明pbaf的半衰期短,而如果用sirna抑制其独有的arid2亚基则可以降低pbaf的蛋白水平。因此推断,arid2对于维持pbaf的稳定性有重要作用。有趣的是,最近一项对于肾透明细胞肿瘤的外显子序列研究表明,41%的pbrm1基因存在短缩变异。pbrm1编码baf180蛋白,其为pbaf复合物亚基。第三种pbaf复合物亚基变异致瘤的brd7基因。brd7在乳腺癌中经常与野生型p53一起缺失。swi/snf复合物的另一亚基baf的突变在人类肿瘤中也屡见不鲜。50%的卵巢透明细胞肿瘤、30%的内膜肿瘤、83%的胃癌、10%的结直肠癌、19%的膀胱转化细胞癌中都发现了arid1a（baf250a）的失活突变。此外,编码pbaf和baf复合物另一亚基的hsnf5/ini1基因在几乎所有的横纹肌肉瘤中都发现了等位基因的失活变异。这些结果都充分说明了arid2作为具有抗癌作用的swi/snf复合物的专属亚基,属于抑癌基因。越来越多的证据显示,swi/snf复合物介导了ifn诱导启动的细胞染色质重构的抗病毒反应。最近的研究也已经证实了arid2是pbaf复合物的特异性亚基[20]。用sirna沉默arid2可以选择性的抑制ifn-a诱导的ifitm1（interferon-inducedransmembraneprotein1）基因,而不会抑制其他基因。而有趣的是ifitm1是肝细胞肿瘤或其他非恶性肝细胞ifn介导的抗增生所必须的因子。因此,arid2在ifn诱导的基因反应和抗增生功能中不可或缺。它在ifn反应元件的表达中起调控作用,可以推测它对抗病毒和抗增生都有作用,被抑制后可下调细胞在抗病毒时的抗增生反应。此外,由于感染细胞缺失了arid2则使其表达mhci类分子表达下调,使得这些异常的细胞也很难被nk细胞和细胞毒性t细胞发现并杀灭。这些异常细胞继续保持增生且维持基因受损染色质变异的状态直至真正形成完全意义上的肿瘤。尽管arid2在肿瘤的作用中被广泛研究,但是mir-208-3p和arid2在肝细胞肝癌中的关系却没有涉及。在本研究中,由tgfβ1调控的mir-208-3p在肝细胞肝癌中高表达与arid2成负相关。此外,mir-208-3p下调抑制了hcc的增生和侵袭能力,且在裸鼠体内也证实了mir-208-3p下调抑制了肿瘤的生长。在hcc细胞系中mir-208-3p直接调控arid2,arid2蛋白耗竭可以翻转mir-208-3p下调产生的肿瘤抑制效果。这些结果都提示了mir-208-3p/arid2途径在hcc中的重要性,并为临床治疗提供了新的潜在靶点。材料和方法一、细胞培养和临床标本hepg2和hep3bhcc细胞系购买自美国模式培养物保藏所（atcc,rockville,md,usa）。hepg237°c和5%co2培育保存在dulbecco’smodifiedeagle’smedium（gibco,grandisland,ny,usa）含10%胎牛血清（fbs）。hep3b37°c和5%co2培育保存在含10%胎牛血清的基础培养基内（gibco,grandisland,ny,usa）。人类临床hcc标本（n=20）和同个体周边正常对照组织（n=20）保持一致由西南医院肝胆外科提供。样本信息见表s1。二、小分子干扰rna（sirna）,mimics,dna构建mirna抑制剂购自genewiz（suzhou,china）。mirnamimicsandsirna购自genepharmaco.,ltd.（shanghai,china）。全长arid2的dna片段（5,508bp）由pcdna3.1载体合成克隆,同时用notiandxbai构建mir-208-3pandarid2表达质粒。arid2野生型3-untranslatedregion（utr;156bp）和变异型3-utr（156bp）由genewiz（suzhou,china）用nheiandsali合成并插入到pmirglodual-luciferasereportervector（promega,madison,wi,usa）。三、荧光素酶报告基因检测hepg2和hep3b细胞按照1×103/孔在37°c和5%co2的条件下种植在96孔板里。24小时后同时转染luciferasereporter质粒和mirna表达质粒或其对照空白质粒。转染48小时后收取细胞。用dual-glo®luciferaseassaysystem（promega,madison,wi,usa）检测萤火虫荧光活性,renilla为标准化底物。转染重复3次。四、细胞增殖检测检测hcc增殖用mtt法和克隆形成实验。mtt检测法中细胞按2×103cells/孔的终浓度种植在96孔板中。在转染后24、48、72小时分别加入mtt（0.5mg/ml）37°c孵育4小时,检测490nm的吸光度值。克隆形成实验中hcc细胞按2×103cells/孔的终浓度种植在6孔板中。分别在转染7天（hep3bcells）和10天（hepg2cells）后用甲醇固定,2%giemsasolution（merck,germany）染色克隆细胞。五、5-溴-2-脱氧尿核苷（5-bromo-2’-deoxyuridine,brdu）标记和流式细胞检测细胞按2×105cells/孔的终浓度种植在6孔板中。转染后用brduflowkits（bdpharmingensandiego,ca）中的brdu-fluoresceinisothiocyanateantibodies和7-aminoactinomycind染色并以10μmbrdu孵育40分钟的转染细胞后,上机检测。六、细胞侵袭实验转染细胞用含2%fbsdmem/mem培养基种植在matrigel-coatedtranswellcell-cultureinserts（invitrogencarlsbad,ca,usa）中。含10%fbs的dmem培养基注入底层诱导细胞移行。迁移持续8小时,其后轻轻洗涤并以crystalviolet染色。显微镜记录迁移的细胞。七、western蛋白印记分析用sdselectrophoresis（sds--page）page凝胶电泳分离转移10ug总蛋白到聚偏氟乙烯膜（millipore,ma,usa）上。山羊血清封闭膜分别和arid2（abcam,cambridge,uk）,tgfβ1（abcam,cambridge,uk）,和gapdh（abcam,cambridge,uk）多克隆兔抗孵育。然后和标记辣根过氧化物酶羊抗兔二抗（cstinc.,danvers,ma,usa）共同孵育。化学发光法（amershambiosciencesuk,ltd.,littlechalfont,buckinghamshire,uk）检测蛋白含量并显影。八、裸鼠成瘤实验5-6周大的balb/cnudemice（购自theanimalcenterofthechineseacademyofscience,shanghai,china）随机分为8组,每组6只,分别皮下注入hcc细胞（1×107cellsin100μlpbs）。每隔3天检测肿瘤外观,28天后处死并测量肿瘤大小。肿瘤大小计算公式:肿瘤大小=长×宽×宽×0.5。九、数据分析数据分析应用spss（spssinc.,chicago,il,usa）软件。所有数据用平均值±标准偏差表示。t检验和单因素方差分析决定是否有统计学意义,p<0.05考虑有统计学意义的差异。研究结果一、mir-208-3p高表达直接降低hcc的arid2的表达水平为了检测是哪一种mirna调控arid2的表达水平,选取4种包含了arid2结合位点的mirna,mir-203,mir-208-3p,mir-132,以及mir-155。蛋白印记分析结果是hcc中,hepg2和hep3barid2的表达水平低于其他3个细胞系（fig.1a）。同时qrt-pcr结果也显示这两系细胞mir-208-3p高表达。此外在hepg2和hep3b细胞中,mir-208-3p的表达水平高于其他3种mirna（fig.1bandc）。为进一步证实mir-208-3p和arid2之间的关系,hepg2和hep3b细胞系转染mir-208-3p抑制剂后arid2表达水平显著上调（fig.1dande）。luciferasereporterassay表明mir-208-3p是直接结合在arid2的3-utr端的（fig.1f）。而我们也发现arid2的mrna水平在hcc标本中低表达且和mir-208-3p表达水平负相关（fig.1gandh）。这些发现都证实了mir-208-3是直接与arid2的3-utr结合并抑制其表达。二、mir-208-3p表达水平下调抑制hcc增殖和侵袭能力为研究hcc中mir-208-3p的功能,我们用mir-208-3p抑制剂转染hepg2和hep3b细胞系,然后用mtt法、克隆形成实验、transwell法和流式细胞仪检测hcc的增值和侵袭能力。mtt、克隆形成实验和流式细胞检测结果都证实了mir-208-3p表达下调抑制hcc的增值能力（fig.2a,bandc）,而transwell结果显示mir-208-3p抑制剂可以抑制hcc的侵袭能力（fig.1d）。三、hcc中arid2过表达显示了和mir-208-3p表达下调近似的效果以上结果提示了mir-208-3p直接降低arid2的表达且促进hcc的演进,考虑到mirnas属于调节性基因,我们假设hcc中mir-208-3p的功能是有arid2体现的。为证实这一假设,arid2过表达质粒被转染入hepg2和hep3b细胞系。wb结果显示arid2和ifitm1在转染arid2过表达质粒后表达水平明显上调（fig.3a）。克隆形成实验和流式细胞检测结果显示arid2过表达抑制hcc的增生（fig.3bandc）。而与对照组相比,arid2过表达同时也抑制了hcc的侵袭能力（fig.3d）。四、降低arid2水平可部分逆转mir-208表达下调引起的效应为进一步证实arid2在mir-208-3p调控体系中的作用,预先用arid2的sirna下调了hepg2和hep3b细胞中arid2蛋白的表达水平,转染arid2特异性sirna后的hcc表达arid2显著下调（fig.4a）。然后检测恢复下调arid2后hcc细胞的增值和侵袭能力。结果显示在加入mir-208-3p抑制剂后沉默arid2的表达可以恢复hcc细胞的增生（fig.4bandc）和侵袭能力（fig.4d）。这些数据都提示了hcc中mir-208-3p的功能很大程度上是由arid2来实现的。五、mir-208体内抑制hcc肿瘤形成为观察mir-208-3p的体内效应,我们分别将空白对照和mir-208-3p抑制剂预处理过的hepg2和hep3b细胞注入裸鼠皮下。28天后处死取出肿瘤并照相记录。低表达mir-208-3p的裸鼠肿瘤体积明显小于对照组（figs.5aand5b）,rt-pcr和wb检测分析mir-208-3p和arid2的表达水平,结果显示转染mir-208-3p抑制剂组的mir-208-3p表达水平较对照低,而arid2表达水平较对照组高（fig.5dande）。以上结果都提示mir-208-3p下调抑制hcc的体内成瘤能力。六、mir-208-3p介导hcc细胞中tgfβ1对arid2的抑制作用向hep3b细胞单独或协同mir-208-3pmimics或controlmimics转染tgfβ1-specificsirna以了解arid2是否是tgfβ1/mir-208-3p调控途径下游因子,用wb检测tgfβ1,arid2和ifitm1的蛋白表达水平,用qrt-pcr检测mir-208-3p的表达水平。转染TGFβ1-specific si RNA可以显著抑制TGFβ1和mi R-208-3p的表达,却显著上调ARID2和IFITM1的表达水平。TGFβ1 siRNA的这些效应可以被mi R-208-3p mimics所逆转（Fig.6A and B）。Transwell实验和克隆形成实验结果都表明,敲除TGFβ1显著抑制HCC细胞的侵袭转移和克隆形成能力,而mi R-208-3p mimics却可以逆转以上由TGFβ1表达下调引起的效应（Fig.6C and D）。这些结果都提示了mi R-208-3p介导了TGFβ1对ARID2起调控作用的新发现的调控路径（Fig.6E）。研究结论最近这几年,越来越多的研究者选择将mi RNAs作为肿瘤潜在治疗方向。比如,mi R-122a在HCC中低表达且与cyclin G1的表达负相关[22]。此外,在肝细胞肝癌的发生过程中通过调控多种因子的调节,miR-124和miR-203的表达下调并且肿瘤的生长受到抑制[23]。与此相对的是TGFβ活化TIMP3介导转录的mi R-181b表达上调促进HCC细胞的增生和侵袭能力[24]。而且HCC中mi R-21和mi R-17-92表达上调,敲处后肿瘤的生长显著受抑制[9]。之前对mi R-208的研究主要集中在心肌损害、EMT和肿瘤生物学调控等方面[14,15,25]。但是在HCC中的作用机制却几乎没有涉及。在本实验中,HCC样本相较于癌旁组织高表达mi R-208-3p。就Hep G2和Hep3B细胞系来说,下调mi R-208-3p的表达显著抑制HCC细胞的增生和侵袭性,且能在裸鼠体内抑制成瘤。并且证实了在HCC中mi R-208-3p的表达水平和ARID2的表达水平负相关。为了研究miR-208-3p和ARID2的潜在关系,我们用luciferasereporter法和WB检测其表达。结果表明miR-208-3p直接结合到ARID2的3-UTR抑制其表达。而在非小细胞肺癌和HCC中,ARID2发生突变于是丧失了抑癌功能[19,20]。本实验中,HCC的ARID2表达下调促进了肿瘤的增殖和侵袭,其过表达则结果相反。此外ARID2的过表达可以部分逆转HCC中miR-208-3p敲处的效应。早期研究表明miR-208受到TGFβ1调控,参与TGFβ1-SMAD4-ARID2调控路径[26,27],而ARID2作为PBAF的亚基调控IFITM1的表达[16],而后者可以加强p53的转录活性抑制HCC细胞增生和肿瘤形成[28]。我们的实验结果是,沉默TGFβ1可以抑制miR-208-3p从而上调ARID2和IFITM1的表达。而同时转染miR-208-3p mimics可以逆转此效应,并且部分逆转TGFβ1 siRNA导致的肿瘤增殖和侵袭能力受损的效应。这些结果都让我们更明确了ARID2在肿瘤调控体系中的作用。